【摘 要】
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莽草酸代谢途径(shikimic acid pathway)是植物、微生物用于合成三种芳香族氨基酸苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸的途径，中间代谢产物莽草酸还可用于合成维生素、己二酸等化合物。
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莽草酸代谢途径(shikimic acid pathway)是植物、微生物用于合成三种芳香族氨基酸苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸的途径，中间代谢产物莽草酸还可用于合成维生素、己二酸等化合物。本文主要针对谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）的莽草酸途径开展工作。通过对调控元件、功能元件的表征及新元件的挖掘来对途径进行改造，提升莽草酸的产量。谷氨酸棒杆菌莽草酸途径中的ncgl1559、ncgl0408分别被注释为3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶。ncgl0409、ncgl1567均被注释为莽草酸脱氢酶。本研究对这四个基因的产物进行了酶学表征，结果表明ncgl1567参与莽草酸的合成，其酶活不受三种芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp的反馈抑制作用。 本研究对莽草酸途径中的aroG（ncgl2098）、aroB（ncgl1559）、aroD(ncgl0408)、aroE(ncgl1567)四个基因分别建立了核糖体结合位点(RBS)突变库。利用不同的RBS对各基因的表达进行调控。通过将每个库中挑选的高(H)、中(M)、低(L)三种不同强度的RBS进行组合，得到了9个模块。为控制表达精度，每个模块中都加入了调控元件RiboJ。将各模块转入菌株C.glutamicumRES167△aroK（在C.glutamicum RES167的基础上敲除莽草酸激酶AroK）进行莽草酸生产，发现GHBMDMEM（G、B、D、E分别代表aroG、aroB、aroD、aroE，H代表高强度RBS、M代表中等强度RBS）组合的莽草酸产量提升了7倍。在转录翻译的水平继续对GHBMDMEM模块进行调节，发现在aroB基因后插入终止子可以提升莽草酸的产量。通过RBS来上调或下调aroB、aroE基因的表达并不能进一步提升莽草酸的产量。对发酵过程所使用的碳源、氮源、IPTG诱导浓度等因素进行了研究，确定了以蔗糖、尿素、酵母浸膏及蛋白胨为主要成分的培养基。通过表达tktA、ppsA基因来增加莽草酸途径前体的供应，菌株C.glutamicumRES167△aroK pXMJ19/GBTDE pECXK99E/tktA-ppsA在摇瓶实验中莽草酸的产量达到了6.9 g/L，在5L发酵罐的补料发酵过程中莽草酸的产量为19.5g/L。将构建的莽草酸生产模块转入菌株AS1.229用于色氨酸的生产，色氨酸的产量提升了30％。对可能用于莽草酸生产的元件进行挖掘。成功设计了一条莽草酸生物合成新途径。筛选了MMP0686、MMP0293、MJ_1249、MM1271、MM1272、MM0714、OE1475F、DvM_1750、ECDH10B_1033等9个来源于不同种属的基因。其中MM1271、MM1272、MM0714、ECDH10B_1033组成的异源模块明显提升了菌株C.glutamicum RES167△aroK的莽草酸产量。MM1271、MM1272、MM0714、ECDH10B1033经过蛋白质质谱检测有明显表达，且检测到了丙酮醛合酶(ECDH10B1033编码)的酶活。
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