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近年来的研究表明,幼龄仔猪精氨酸不足,是制约仔猪生长达到最佳状态的一个重要因为。N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS,N-acetylglutamate synthase)是参与精氨酸内源合成的关键酶之一,它催化乙酰辅酶A与L-谷氨酸合成N-乙酰谷氨酸(NAG),NAG是精氨酸合成途径的必需辅助因子。因此,提高NAGS表达可能是提高哺乳仔猪肠道内源精氨酸合成的潜在方法。本文旨在探讨仔猪肠道NAGS的发育表达模式,并添加一些有效物质对NAGS的表达进行调控。为此,开展了4个实验:①仔猪NAGS cDNA的克隆。②NAGS多克隆抗体的制备。③哺乳仔猪不同阶段肠道NAGS mRNA和蛋白表达的发育模式。④日粮添加N-甲酰谷氨酸(NCG)和精氨酸对断奶仔猪肠道NAGSmRNA和蛋白表达的影响。
试验①:根据人和小鼠的NAGS基因序列,用RT-PCR方法从哺乳仔猪(杜×长×大三元杂交猪)肝脏中扩增了NAGS的开放阅读框保守区,测序,获得猪NAGS核苷酸序列,长1,107 bp,编码368个氨基酸,提交至Genbank,登录号为EF429095。
试验②:将NAGS基因连接到原核表达载体上,将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下表达his-NAGS融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳,得出NAGS分子量约为40 kDa。NAGS蛋白经一步亲和层析纯化后,注射到新西兰大白兔中制备多克隆抗体。对多克隆抗体进行免疫组化和免疫印迹测试的结果表明,此抗体有较好的抗原性和特异性。
试验③:挑选体重接近的健康新生藏仔猪30头(随机分为5组)和三元杂交仔猪(杜×长×大)24头(随机分为4组),雌、雄各半,均为母乳喂养,分别于第1、7、21、28和35日龄(三元猪无35日龄组)处死。分别采用实时定量PCR和Western blotting方法对哺乳仔猪空肠和回肠NAGS mRNA和蛋白表达的发育性变化进行了检测。结果表明,哺乳仔猪空肠与回肠的NAGSmRNA表达水平(P<0.05)和蛋白丰度(P<0.01)均随日龄增长呈下降趋势。哺乳仔猪NAGS mRNA和蛋白表达的模式与此阶段内源合成精氨酸缺乏相吻合,提示哺乳阶段NAGS表达的发育性变化可能足内源性精氨酸合成减少的一种重要机制。
试验④:本实验选用84头21日龄体重接近(5.64±0.48kg)的二元杂(长×大)断奶仔猪,研究日粮添加精氨酸及精氨酸衍生物(NCG)对N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)mRNA和蛋白表达的影响。动物随机分为3组,每组4个重复,每个重复7头,分别饲喂不同日粮,即(1)基础日粮,(2)基础日粮添加0.6％的精氨酸,(3)基础日粮添加0.08％的NCG,试验期为7天。分别采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法检测空肠和回肠中NAGS mRNA和蛋白的表达水平,并测定血浆精氨酸家族中主要氨基酸的浓度。结果表明:与对照组相比,日粮中添加0.08％的NCG显著提高了空肠和回肠NAGS mRNA和蛋白表达(P<0.05),而且,血浆精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸浓度升高,血浆谷氨酸浓度降低。日粮中添加0.6％精氨酸显著提高了回肠NAGS蛋白表达,(P<0.05),对回肠NAGS mRNA、空肠NAGS mRNA和蛋白水平均无显著影响(P>0.05)。添加NCG组与添加精氨酸组相比,前者空肠和回肠NAGS mRNA和蛋白表达水平都显著高于后者(P<0.05)。这些结果表明,日粮添加NCG能促进断奶猪肠道NAGS mRNA和蛋白的表达,从而促进内源精氨酸合成。