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从辛香料中攫取具有高度活性的有效成分用于疾病的预防与治疗是现代新药研发的重要方向和新途径。但因辛香料活性成分性质各异,其稳定性、溶解度、刺激性、生物利用度等问题的解决是扩展其临床应用的重要瓶颈。利用现代药剂学先进的药物传递技术、载体技术及纳米技术,能够有效的改善药物传递中的关键问题。本文分别选用水溶性和难溶性的辛香料活性成分绿原酸及辣椒碱,在尝试解决其稳定性、溶解度、刺激性、生物利用度等问题的过程中,引入了脂质体技术、前药自组装纳米技术及其联用技术,探索了多种纳米制剂技术在实现辛香料活性成分高效传递中的关键科学问题,为不同类型辛香料活性成分的开发应用提供新的策略,为实现辛香料活性成分的临床应用提供新方法与新载体。第一章辛香料活性成分及其纳米脂质体制剂研究进展对辛香料活性成分的药理作用及其纳米脂质体制剂研究进展进行了综述,总结了辛香料药理活性,明确辛香料作为药食同源的药物开发价值。对纳米脂质体制剂的研究进展进行了综述,立足于解决不同性质的辛香料活性成分开发所遇到的各种难点问题。同时,提出本论文的设计思路与构想,为本论文实验的顺利开展提供了理论基础。第二章绿原酸纳米脂质体的研究及其体内高效生物利用与活性评价构建绿原酸纳米脂质体给药系统,通过薄膜分散法制备绿原酸脂质体,并考察其外观、粒径、包封率、稳定性等性质。建立HPLC法,用于测定绿原酸脂质体在大鼠体内的生物利用度和小鼠体内的组织分布情况,并进行方法学验证。考察绿原酸脂质体在大鼠体内的生物利用度及小鼠中的组织分布情况,并考察绿原酸脂质体对于小鼠体内抗氧化药效的影响,揭示脂质体对生物利用度的影响与药效作用之间的联系。1.绿原酸的提取与分离工艺的研究以50%的乙醇提取杜仲粉末,采用无水乙醇、水对粗提物进行再次提取后,采用大孔树脂与C8柱对其进行纯化,得绿原酸白色粉末。采用1H-NMR与HPLC法对单体进行了结构与纯度鉴定,结果表明,提取所得绿原酸的纯度大于99.5%。2.绿原酸脂质体的制备及体外性质考察构建绿原酸纳米脂质体给药系统,通过薄膜分散法制备绿原酸脂质体。所得绿原酸脂质体为均匀的具有蓝色微光混悬液,平均粒径为132.15±3.03 nm,多分散性指数为0.18±0.08,Zeta电位为-23.08±2.41 m V,呈类球形均匀分布,大小与粒径分布数据一致。透射电镜观察显示,绿原酸脂质体具有多层结构,属于多层脂质体。以葡聚糖凝胶色谱法测得绿原酸脂质体的包封率为53.08±0.92%。初步稳定性实验结果表明,绿原酸脂质体具有较好的稳定性,其平均粒径、多分散性指数、包封率等主要指标均无明显变化。3.绿原酸脂质体在大鼠体内生物利用度与小鼠组织分布的考察建立HPLC法,用于测定绿原酸脂质体在大鼠体内的生物利用度和小鼠体内的组织分布情况,并进行方法学验证。色谱条件为:仪器:Shimadzu LC-10ATvp高效液相色谱仪;SPD-m10Avp二极管阵列检测器;SIL-20A自动进样器;色谱柱:Waters,Symmetry(C18,4.6×150 mm,5μm);流动相:甲醇-水(0.1%磷酸)(30:70);流速:1.0 m L·min-1;检测波长:327 nm;柱温:30℃;进样量:20μL;内标:葛根素。线性范围为0.125-50μg·m L-1(R2=0.9999),绝对回收率均>85%,相对回收率在95.1%-102.4%之间,RSD均小于3%;日内、日间精密度RSD<5%,样品稳定性良好,符合样品体内分析要求。绿原酸大鼠体内生物利用度研究结果表明,口服给药后,绿原酸脂质体的Cmax和AUC0-11h相比于绿原酸原料药均有显著提高(p<0.01),相对生物利用度为129.38%。绿原酸脂质体的Tmax由原料药的10 min推迟至15 min。游离绿原酸和绿原酸脂质体均在120 min时出现双峰现象。而t1/2虽然略有减小,但是无显著性变化(p?0.05)。绿原酸脂质体小鼠组织分布实验表明,绿原酸纳米脂质体与绿原酸体内分布情况具有较大差异。与原料药相比,绿原酸脂质体降低了药物在心脏中的分布,增加了在肝脏和脾脏中的蓄积。纳米制剂延长了绿原酸在肝脏中的停留时间,延缓了其在体内的代谢。同时发现,15和45 min时,原料药中肾脏药物分布较高,而绿原酸脂质体在120 min时肾脏药物分布较高,提示脂质体可以延缓绿原酸在体内的消除。4.绿原酸脂质体小鼠体内抗氧化活性研究建立四氯化碳小鼠肝损伤模型,考察绿原酸纳米脂质体给药系统对于抗氧化作用的提升效果,揭示生物高效利用与体内药理活性之间的关系。结果表明:绿原酸及其脂质体均具有较好的体内抗氧化效果,二者对小鼠血浆和肝脏中的SOD、GSH-Px和T-AOC的活性均有显著提高作用,而对MDA含量有显著降低作用。而经过脂质体包封后,其体内抗氧化活性较绿原酸原料药显著提高。CAL抗氧化效果的增加,很大程度上是由于CAL对CA生物利用度的提高和CA在肝脏的被动靶向作用而导致的肝脏中CA分布的增加。第三章辣椒碱前药自组装纳米粒的制备及性质评价本章将前药自组装纳米技术应用于辣椒碱的提高生物利用度与降低刺激性开发研究。以亚二硫基二乙酸为链接,合成辣椒碱-维生素E衍生物前药(CAPSVE),并进一步制备辣椒碱前药自组装纳米粒(CAP-SVE NPs)。对CAP-SVE NPs进行形态观察,溶解度,粒径,电位,稳定性等性质评价,并考察其体外释放特性。1.以亚二硫基二乙酸为链接,合成CAP-SVE,前药结构经LC-MS、13C-NMR、1H-NMR分析,与设计结构相符。以面积归一化法计算,纯度大于99.5%。制备的CAP-SVE NPs对辣椒碱的增溶效果显著,可达到8 mg?m L-1。2.建立HPLC法同时测定辣椒碱和辣椒碱前药的含量。色谱条件为:色谱柱:岛津Shim-pack CLC-C8(M)(150×4.6 mm L.D)流动相:0.75%甲酸(A)-甲醇(B);梯度洗脱:0 min 70%B,2 min 70%B,2.01 min 100%B,15 min 100%B;流速:1.0 m L?min-1;柱温:30°C;检测波长:280 nm;进样量:20μL。经方法学验证,线性范围均为0.5-100μg?m L-1,日内、日间精密度、样品稳定性均良好,符合检测方法学要求。3.对CAP-SVE NPs进行形态观察,溶解度,粒径,电位,稳定性,体外释放等性质评价。CAP-SVE NPs平均粒径为159.12±1.55 nm,多分散性指数为0.16±0.04,Zeta电位为-39.49±1.78 m V。透射电镜观察结果显示,CAP-SVE NPs呈类球形均匀分布,且其粒径大小与所测结果一致。理论浓度为2 mg·m L-1、4mg·m L-1、8 mg·m L-1的CAP-SVE NPs的载药量分别为1.93±0.02 mg?m L-1,3.97±0.04 mg?m L-1和7.95±0.03 mg?m L-1。CAP-SVE NPs具有较好的稳定性,其含药量和平均粒径等主要指标在初步稳定性实验条件下均无明显变化。体外释药实验表明,辣椒碱自组装纳米粒在不同介质中的释药行为大为不同。在p H7.4的介质中释放辣椒碱最快,p H6.8的介质中释放较快,在水和p H1.2的介质中几乎无释放。第四章辣椒碱前药脂质体的制备及其体外性质评价本章将前药自组装纳米技术与脂质体纳米技术相结合,进一步制备辣椒碱前药脂质体(CAP-SVE Liposome)。透射电镜形态考察结果显示,CAP-SVE Liposome呈类球形均匀分布,大小与粒径分布所测得数据保持一致。平均粒径为159.72±3.29 nm,多分散性指数为0.28±0.01,Zeta电位为-71.05±1.44 m V,包封率为98.33±0.68%。以外观、粒径及含药量为指标评价CAP-SVE Liposome半个月的初步稳定性,实验表明,CAP-SVE Liposome在4℃、25℃、40℃条件下均非常稳定,且结果与CAP-SVE NPs稳定性结果较为一致。以透析法研究CAP-SVE Liposome的体外释药特性,结果显示,辣椒碱前药纳米脂质体在水及p H1.2的释药介质中,释药速率以前药计算,释药曲线与CAP-SVE NPs相比略缓。而在p H6.8及p H7.4的释药介质中,释药速率以辣椒碱计算,显著低于辣椒碱前药纳米粒。第五章辣椒碱前药自组装纳米粒及其脂质体的体内高效生物利用与组织分布研究1.建立了HPLC法测定大小鼠血浆及小鼠组织中辣椒碱的含量。色谱条件:流动相:0.75%甲酸-甲醇(35:65);流速:1.0 m L?min-1;柱温:30°C;检测波长:280 nm;进样量:20μL。线性范围为0.1-10μg?m L-1,回收率、日内、日间精密度、样品稳定性均良好,符合检测方法学要求。2.考察辣椒碱前药自组装纳米粒及其脂质体大鼠体内生物利用度情况,结果显示,与原料药相比,CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome大鼠注射给药后Cmax显著提高。两种前药纳米制剂的辣椒碱大鼠体内2小时内药时曲线下面积AUC0-2h值较原料药显著提高,分别为原料药的2.1倍和3.3倍。而两种前药纳米制剂的半衰期t1/2相比于原料药而言减小。口服给药后,与辣椒碱原料药相比,两种辣椒碱前药纳米制剂大鼠体内Cmax显著提高,前药自组装纳米粒和前药脂质体分别提高了1.92倍和1.81倍。Tmax和t1/2显著延长。口服给药后,12小时内药时曲线下面积AUC0-12h显著提高,CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome的相对生物利用度分别为原料药的3.2倍和4.4倍。结果表明,两种辣椒碱前药纳米制剂显著提高了辣椒碱的口服生物利用度,并具有缓释作用,且CAP-SVE Liposome的提高生物利用度和缓释效果更好。3.两种辣椒碱前药纳米制剂小鼠体内组织分布实验表明,CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome改变了辣椒碱的体内分布特征。与原料药相比,前药及前药脂质体均增加了药物在肝脏和脾脏中的靶向效果,延长了药物作用时间,降低了药物在肾脏的蓄积,且具有脑靶向效果。第六章辣椒碱前药自组装纳米粒及其脂质体的胃肠道刺激性及药效学研究本章通过考察辣椒碱前药自组装纳米粒及其脂质体对于胃肠道的刺激性、对于肝损伤小鼠抗氧化活性的影响以及降血脂药效的影响,揭示辣椒碱前药纳米制剂分子结构与刺激性改变之间的关系及药动特征与药效提高之间的关系。1.胃肠道刺激性实验结果表明,与原料药组相比,两种辣椒碱前药纳米制剂对于胃粘膜无明显的损伤,显著降低辣椒碱的胃部刺激性。对于大鼠各段肠道,辣椒碱前药纳米制剂给药后,十二指肠、空肠、回肠黏膜病理切片图中肠粘膜黏膜组织结构完好,肠绒毛结构较为完整,形态正常,而辣椒碱原料药给药后的各段肠粘膜组织细胞固缩、肠绒毛损伤严重。由此可见,CAP-SVE NPs及CAP-SVE Liposome均能显著降低口服辣椒碱对于胃肠道的刺激性,且CAP-SVE Liposome效果更为明显。2.建立四氯化碳小鼠肝损伤模型,考察辣椒碱前药自组装纳米粒及其脂质体对于抗氧化作用的影响。小鼠体内抗氧化活性研究结果表明:CAP-SVE NPs及CAP-SVE Liposome均能增加辣椒碱在体内的抗氧化活性。两种前药纳米制剂均能减轻CCl4造成的小鼠肝脏水肿、充血等损伤,显著降低了小鼠血浆中MDA的含量,显著提高了小鼠血浆中T-SOD、GSH-Px和的T-AOC活性,相比于辣椒碱原料药具有显著性优势,且CAP-SVE Liposome相比于CAP-SVE NPs具有显著性优势。3.辣椒碱前药纳米制剂小鼠体内降血脂活性研究结果表明:两种辣椒碱前药纳米制剂均能显著降低高血脂小鼠模型血浆中胆固醇、甘油三酯、胆汁酸、低密度脂蛋白的水平,显著提高高密度脂蛋白的水平;并显著降低其肝脏总重、肝脏总脂肪含量以及肝脏总胆固醇及甘油三酯的水平。相比于辣椒碱原料药,两种辣椒碱前药纳米制剂具有显著性优势,且CAP-SVE Liposome相比于CAP-SVE NPs具有显著性优势。肝脏细胞HE染色病理切片表明,辣椒碱前药纳米制剂均能减少高脂饮食小鼠肝脏中脂肪滴的聚集,减轻肝细胞肿胀、脂肪变性等损伤。以上实验表明,辣椒碱及其前药纳米制剂均能改善高脂饲料对小鼠的肝损伤,且前药自组装纳米粒改善作用较辣椒碱原料药更为明显,CAP-SVE Liposome改善作用最佳。此结果与辣椒碱药动学及组织分布特征相符合。