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【目的】
1.从人脐带组织中分离培养间充质干细胞(MSC)，收集细胞上清分离外泌体(MSC-exo)，鉴定MSC及MSC-exo的基本特性。
2.探讨MSC-exo对血管内皮细胞衰老的影响。
3.MSC-exo-miR-21-5p的鉴定及其对血管内皮细胞衰老的影响。
【方法】
1.从人脐带中分离培养MSC，利用CD29、CD44、Sca-1(阳性)和CD117、CD31(阴性)单克隆抗体进行流式细胞仪检测，以及成脂肪、成骨多向分化等方法鉴定MSC。MSC培养3~4代，收集细胞上清液，采用超速离心法提取上清液中MSC-exo，并通过电镜、Nanosight粒径分析以及Westernblotting等方法鉴定MSC-exo。
2.MSC-exo用PKH67(绿)标记后与血管内皮细胞(HUVECs)共培养，DAPI染核，DID染细胞质，通过荧光显微镜观察HUVECs细胞对MSC-exo的摄取情况。将MSC-exo与HUVECs细胞共培养(原培养基的血清去除外泌体)，并通过SA-β-gal衰老染色、BrdU细胞增殖、小管形成、Transwell以及Westernblotting等方法，检测MSC-exo对HUVECs细胞衰老、增殖、血管生成、迁移以及衰老相关蛋白的影响。
3.miRNA测序筛选MSC-exo中丰度高的miRNAs，并利用荧光定量RT-PCR进行验证。将MSC-exo与HUVECs细胞共培养，荧光定量RT-PCR筛选处理前后表达倍数明显增加的miRNAs进行深入研究(本研究筛选miR-21-5p进行下一步研究)。在HUVECs细胞中分别转染mimic和inhibitor以增加和抑制miR-21-5p的表达，并通过SA-β-gal衰老染色、BrdU细胞增殖和小管形成等方法，检测miR-21-5p对HUVECs细胞衰老、增殖和血管生成能力的影响。
【结果】
1.MSC的分离培养及MSC-exo的提取鉴定
本研究从人脐带中分离MSC，细胞呈长梭形、涡旋状生长；流式细胞仪鉴定表面抗原分子发现CD29、CD44、Sca-1(阳性)，CD117、CD31(阴性)；成脂肪、成骨多向诱导分化可见明显成骨钙结节和脂肪小滴，符合间充质干细胞的特性。用无外泌体培养基培养MSC，收集细胞上清，超速离心法分离得到的MSC-exo在电镜下呈椭圆形茶杯状，粒径大小在50~150nm之间，可检测到TSG101、CD63和CD81等蛋白分子，符合外泌体的基本特性。
2.MSC-exo对血管内皮细胞衰老的影响
将MSC-exo与HUVECs细胞共培养，荧光显微镜观察表明MSC-exo可被HUVECs细胞摄取，且MSC-exo可显著下调衰老相关蛋白p16的表达，延缓HUVECs细胞衰老，并促进细胞增殖、血管生成和细胞迁移能力。
3.MSC-exo-miR-21-5p的鉴定及其对血管内皮细胞衰老的影响
利用miRNA测序和荧光定量RT-PCR进行验证，结果发现在miR-21-5p等miRNAs在MSC-exo中具有较高丰度。在HUVECs细胞中转染mimic过表达miR-21-5p，可显著延缓HUVECs细胞衰老，促进细胞增殖和血管生成能力。相反，在HUVECs细胞中转染inhibitor抑制miR-21-5p的表达，可显著促进HUVECs细胞衰老，抑制细胞增殖和血管生成能力。
【结论】
MSC-exo与HUVECs细胞共培养可显著延缓血管内皮细胞衰老，促进细胞增殖、血管生成和迁移能力。miR-21-5p在MSC-exo中丰度较高，MSC-exo可能通过转移miR-21-5p在血管内皮细胞中发挥抗衰老作用。
1.从人脐带组织中分离培养间充质干细胞(MSC)，收集细胞上清分离外泌体(MSC-exo)，鉴定MSC及MSC-exo的基本特性。
2.探讨MSC-exo对血管内皮细胞衰老的影响。
3.MSC-exo-miR-21-5p的鉴定及其对血管内皮细胞衰老的影响。
【方法】
1.从人脐带中分离培养MSC，利用CD29、CD44、Sca-1(阳性)和CD117、CD31(阴性)单克隆抗体进行流式细胞仪检测，以及成脂肪、成骨多向分化等方法鉴定MSC。MSC培养3~4代，收集细胞上清液，采用超速离心法提取上清液中MSC-exo，并通过电镜、Nanosight粒径分析以及Westernblotting等方法鉴定MSC-exo。
2.MSC-exo用PKH67(绿)标记后与血管内皮细胞(HUVECs)共培养，DAPI染核，DID染细胞质，通过荧光显微镜观察HUVECs细胞对MSC-exo的摄取情况。将MSC-exo与HUVECs细胞共培养(原培养基的血清去除外泌体)，并通过SA-β-gal衰老染色、BrdU细胞增殖、小管形成、Transwell以及Westernblotting等方法，检测MSC-exo对HUVECs细胞衰老、增殖、血管生成、迁移以及衰老相关蛋白的影响。
3.miRNA测序筛选MSC-exo中丰度高的miRNAs，并利用荧光定量RT-PCR进行验证。将MSC-exo与HUVECs细胞共培养，荧光定量RT-PCR筛选处理前后表达倍数明显增加的miRNAs进行深入研究(本研究筛选miR-21-5p进行下一步研究)。在HUVECs细胞中分别转染mimic和inhibitor以增加和抑制miR-21-5p的表达，并通过SA-β-gal衰老染色、BrdU细胞增殖和小管形成等方法，检测miR-21-5p对HUVECs细胞衰老、增殖和血管生成能力的影响。
【结果】
1.MSC的分离培养及MSC-exo的提取鉴定
本研究从人脐带中分离MSC，细胞呈长梭形、涡旋状生长；流式细胞仪鉴定表面抗原分子发现CD29、CD44、Sca-1(阳性)，CD117、CD31(阴性)；成脂肪、成骨多向诱导分化可见明显成骨钙结节和脂肪小滴，符合间充质干细胞的特性。用无外泌体培养基培养MSC，收集细胞上清，超速离心法分离得到的MSC-exo在电镜下呈椭圆形茶杯状，粒径大小在50~150nm之间，可检测到TSG101、CD63和CD81等蛋白分子，符合外泌体的基本特性。
2.MSC-exo对血管内皮细胞衰老的影响
将MSC-exo与HUVECs细胞共培养，荧光显微镜观察表明MSC-exo可被HUVECs细胞摄取，且MSC-exo可显著下调衰老相关蛋白p16的表达，延缓HUVECs细胞衰老，并促进细胞增殖、血管生成和细胞迁移能力。
3.MSC-exo-miR-21-5p的鉴定及其对血管内皮细胞衰老的影响
利用miRNA测序和荧光定量RT-PCR进行验证，结果发现在miR-21-5p等miRNAs在MSC-exo中具有较高丰度。在HUVECs细胞中转染mimic过表达miR-21-5p，可显著延缓HUVECs细胞衰老，促进细胞增殖和血管生成能力。相反，在HUVECs细胞中转染inhibitor抑制miR-21-5p的表达，可显著促进HUVECs细胞衰老，抑制细胞增殖和血管生成能力。
【结论】
MSC-exo与HUVECs细胞共培养可显著延缓血管内皮细胞衰老，促进细胞增殖、血管生成和迁移能力。miR-21-5p在MSC-exo中丰度较高，MSC-exo可能通过转移miR-21-5p在血管内皮细胞中发挥抗衰老作用。