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HnRNPG蛋白是hnRNP家族的一员，首先是作为一个43kDa大小左右的细胞核蛋白被鉴定出来的，含有391个氨基酸。在人类细胞中hnRNPG的编码基因因其位于X染色体上且含有RNA结合结构域也被称为RBMX(RNA Binding Motif gene，Xchromosome)，其在细胞内广泛表达。hnRNP家族是一类多功能蛋白，参与到多种细胞生命活动过程，包括染色质重组、转录调控、端粒延伸等。HnRNPG作为hnRNP家族的一员，已有研究表明其参与到胚胎发育、细胞凋亡以及基因转录调控过程。我们实验室在前期大规模激光照射筛选实验中发现hnRNPG能够聚集到激光照射位点，而在我们研究期间，2012年的一篇文献报道中也发现了同样的现象，并且发现hnRNPG干扰后的细胞与对照细胞相比，对损伤试剂的敏感性增强，同源重组修复效率降低，并且HR修复相关蛋白BRCA2的表达下调，但hnRNPG调控BRCA2的分子机制并不清楚。 在先前的文献报道中人们发现在一些DNA损伤试剂，如阿霉素、丝裂霉素C处理细胞后BRCA2表达水平有所下调，且该过程受P53的调控。而hnRNP家族的另外一个蛋白hnRNPK能够通过与P53相互作用募集到DNA损伤应答基因p21的启动子区域调控其表达。综上所述，我们猜测hnRNPG，P53调控BRCA2的表达机制可能与其具有相似性，在本课题中我们尝试去研究hnRNPG与P53相互作用及其对BRCA2的表达的调控机制，最后得到以下结果: 1、HnRNPG聚集到DNA双链断裂损伤位点 将质粒pEGFP-hnRNPG转染进可以在特定位点造成DNA双链断裂损伤的细胞U2OS/TRE/I-SceI-19中，在荧光显微镜下观察hnRNPG的聚集情况，结果显示hnRNPG能够聚集到I-SceI限制性内切酶造成的DNA双链断裂位点，表明hnRNPG参与到DNA双链损伤应答过程中。进一步对hnRNPG聚集的domain分析结果表明hnRNPG蛋白两个独立的domain(131-270 Aa和271-392Aa)可以分别聚集到DNA双链断裂位点。这个结果提示hnRNPG的聚集可能不止一个信号通路。 2、GST-pull down表明hnRNPG与P53具有相互作用 根据hnRNPG蛋白的结构将其分成三段并分别构建进pGEX载体中，在大肠杆菌中表达纯化，后与293的细胞裂解液孵育进行GST-pull down实验，通过Western blot检测发现hnRNPG与P53有相互作用。 3、hnRNPG与P53可以存在直接相互作用 根据hnRNPG蛋白的结构将其分成三段分别构建进pCOLDⅠ载体中，P53构建进pGEX载体中，在大肠杆菌中表达后纯化P53，与hnRNPG的菌液孵育进行GST-pull down实验，通过Western blot检测发现hnRNPG2(131-270 Aa)与P53可以存在直接相互作用。 4、P53与hnRNPG相互作用的domain分析 根据P53蛋白的结构将其分成三段构建进pGEX载体中，在大肠杆菌中表达纯化后与his-flag-hnRNPG2（131-270）的菌液孵育进行GST-pull down实验，通过Western blot检测发现P53通过293-393 Aa段与hnRNPG相互作用。 5、Co-IP表明hnRNPG与P53在细胞内存在相互作用 收集细胞，裂解后将上清液一分为二，其中一份加入1ug(10ul)的P53抗体，通过Dynabeads protein G进行富集后收集beads，Western blot检测hnRNPG，实验结果表明在细胞体内hnRNPG与P53存在相互作用。 6、DNA损伤导致hnRNPG与P53相互作用减弱(CDDP20ug/ml) 用CDDP处理细胞2h后，在不同的时间点收集细胞，分别提取对照组和CDDP处理组的总RNA，对细胞中BRCA2的表达量进行检测，结果表明与对照细胞相比，CDDP处理的细胞中BRCA2表达水平下调，且在2h时表达下调明显。用同样的方法处理细胞后，将细胞裂解液与纯化的大肠杆菌中表达的GST-hnRNPG2进行GST-pull down实验，结果表明CDDP处理后P53与hnRNPG的相互作用与未处理组ctrl相比明显减弱。