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背景椎间盘退行性疾病是一种人群高发性疾病,其发病机理复杂。该疾病现有的临床治疗策略主要以缓解症状为主,不能从病因上防治椎间盘退变进程。因此深入研究和认识椎间盘退变机制具有重要的科学价值,将为寻找新的椎间盘退行性疾病的防治策略提供理论依据。压应力作用是椎间盘退变进程中的重要外部病理因素,以往临床观察和基础研究表明压应力对椎间盘退变发生率和椎间盘细胞的生物学行为具有重要的调控作用。一方面,过度压应力刺激可促进椎间盘退变的发生,另一方面,特定条件的应力刺激可逆转椎间盘退变或维持椎间盘的健康状态。这正反两方面的不同效应提示压应力对椎间盘细胞可能存在“窗口”式生物学效应。此外,相关研究表明髓核细胞凋亡和衰老可能是相关病理因素导致椎间盘退变加速的重要原因。虽然已有研究表明高负荷压应力是椎间盘退变加速的重要外部病理因素,但关于高负荷压应力促进椎间盘髓核细胞凋亡和衰老的作用处于初步研究阶段,其机制有待深入阐明。离体椎间盘器官培养模型是椎间盘研究领域的新兴模型。相对于以往动物体内模型和细胞培养模型而言,它既保留了椎间盘结构的完整性,又可精确地控制应力施加条件和其他理化因素。但由于难以保证椎间盘中央髓核组织充分的营养供应和维持培养环境的稳定性,故维持髓核组织的生物活性是建立离体椎间盘器官培养模型的技术瓶颈。课题组前期自主研发了一种“智能化仿生组织培养系统”,该系统可实时反馈调控培养环境,并能施加不同参数的仿生应力刺激,为建立离体椎间盘器官培养模型提供了技术设备支持,并使压应力生物学效应的研究背景更加接近生理条件。因此,本研究在该智能化仿生组织培养系统的基础上,通过相关策略改善椎间盘中央髓核组织营养供应并优化相关培养参数,优效建立了离体椎间盘器官培养模型;然后在该模型中,通过施加不同参数的仿生压应力,观察了压应力对椎间盘髓核细胞的生物学效应“窗”;最后,深入研究了高负荷压应力促进椎间盘退变的可能途径及其机制。方法第一部分1.分离兔椎间盘,去除两端骨性终板保留软骨终板,随后将离体兔椎间盘随机分为对照组和实验组,实验组中对椎间盘进行预处理,即手术去除约1/3外层纤维环后,低浓度胰酶控制性疏松残余外层纤维环组织;对照组中椎间盘不做该处理。2.椎间盘预处理后,体外用亚甲蓝扩散实验观察两组椎间盘中溶质扩散效率,用组织形态学染色(HE)观察椎间盘软骨终板和内层纤维环的结构变化。3.将两组椎间盘置于智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养,在第7和14天时分析两组髓核细胞活力、组织形态学变化(甲苯胺蓝和HE)、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子(aggrecan和collagen II)的表达、髓核组织中生化组分(糖胺多糖GAG和羟脯氨酸HYP)含量;另外,在第14天时将两组椎间盘髓核组织生物活性与新鲜椎间盘髓核组织比较。第二部分1.按第一部分方法分离猪椎间盘并进行椎间盘培养前预处理。2.利用该智能化仿生组织培养系统,首先将猪椎间盘置于不同葡萄糖水平(低糖:1.0 g/L;普糖:2.0 g/L;高糖:4.5 g/L)、不同渗透压水平(低渗:330 m Osm/kg,等渗:430 m Osm/kg,高渗:550 m Osm/kg)和不同血清水平(5%,10%和20%)培养环境中进行灌注培养7天,通过检测髓核细胞活力、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达和髓核组织中生化组分(GAG和HYP)含量,筛选出最能维持髓核组织生物活性的葡萄糖水平、渗透压水平和血清水平。3.将猪椎间盘在上述优化的培养环境中进一步培养14天后,与新鲜椎间盘髓核组织比较,分析髓核细胞活力、组织形态(阿利新蓝和HE染色)、髓核细胞分布、髓核组织MRI T2加权像、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子(aggrecan和collagen II)的表达、髓核组织中生化组分(GAG和HYP)含量。第三部分1.按第一和第二部分方法进行猪椎间盘分离和椎间盘培养前预处理,并建立离体猪椎间盘器官培养模型。2.利用该智能化仿生组织培养系统对灌注培养中的椎间盘进行施力刺激7天,分别观察不同仿生压应力大小(0.1 MPa、0.2 MPa、0.4 MPa、0.8 MPa和1.3 MPa,其他应力参数为:1.0 Hz的应力频率,2 h每天的应力施加时间)、不同仿生压应力频率(0.1Hz、0.5 Hz、1.0 Hz、3.0 Hz和5.0 Hz,其他应力参数为:0.4 MPa的应力大小,2 h每天的应力施加时间)和不同仿生压应力作用时间(1 h/每天、2 h/每天、4 h/每天和8 h/每天,其他应力参数为:0.4 MPa的应力大小,1.0 Hz的应力频率)对椎间盘髓核组织的生物学效应。没有进行压应力刺激的椎间盘视作对照组。3.培养结束后,分析各组中髓核细胞凋亡、组织形态学变化(阿利新蓝和HE染色)、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子collagen II的蛋白表达、髓核组织中生化组分(GAG)含量。第四部分1.按第一部分方法分离大鼠椎间盘,获取中央髓核组织后,用胰酶和I型胶原酶消化法获取髓核细胞,采用双相接种的方法将髓核细胞接种至支架材料上。然后将含髓核细胞的支架材料置于该智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养5天。同时,每天对髓核细胞施加不同负荷的压应力刺激4 h,具体分组为无应力对照组、低负荷压应力(2%压缩形变)组和高负荷压应力(20%压缩形变)组,压应力频率为1.0 Hz。同时,在高负荷压应力组中,利用通路抑制剂SB203580和清除剂NAC观察p38 MAPK通路和胞内活性氧(ROS)蓄积在高负荷压应力对髓核细胞影响中的作用。培养结束后,分析各组髓核细胞增殖情况、衰老相关β-半乳糖苷酶活性、G 1期细胞周期阻滞比例、衰老相关标志物(p16和p53)的基因和蛋白表达、端粒酶活性、胞内ROS蓄积情况、髓核细胞胞外基质代谢和p38 MAPK通路活性。2.分离大鼠椎间盘后,利用该智能化仿生组织培养系统,建立大鼠离体椎间盘器官培养模型。对离体大鼠椎间盘组织进行施力灌注培养10天,分组为:无压应力对照组、低负荷压应力(0.1 MPa)组和高负荷压应力(1.3 MPa)组,压应力施加频率为1.0 Hz,每天施加时间为4 h。培养结束后,分析各组髓核细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性、衰老相关标志物(p16和p53)的基因和蛋白表达、端粒酶活性、胞内ROS蓄积情况、髓核细胞胞外基质代谢和p38 MAPK通路活性。第五部分1.按第一部分分离大鼠椎间盘,获取中央髓核组织后,用胰酶和I型胶原酶消化法获取髓核细胞,采用双相接种的方法将髓核细胞接种至支架材料上。2.将含髓核细胞的支架材料置于该智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养5天。同时,每天对髓核细胞施加不同负荷的压应力刺激4 h,具体分组为无应力对照组、低负荷压应力(2%压缩形变)组和高负荷压应力(20%压缩形变)组,压应力频率为1.0Hz。施力培养结束后,分析髓核细胞凋亡情况、Caspase 3活性、凋亡相关分子(Bcl-2,Bax,Caspase 3)的基因表达、凋亡相关分子(Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase 3)的蛋白表达、N-CDH的基因和蛋白表达,PI3K/Akt通路活性及下游GSK-3β的活性。3.将髓核细胞进行N-CDH过表达处理后接种至支架材料上,然后给予高负荷压应力刺激,并进行上述指标检测。4.高负荷压应力刺激下,用通路抑制剂LY294002抑制N-CDH过表达髓核细胞中PI3K/Akt通路活性后,再次进行上述指标检测。结果第一部分1.椎间盘器官培养前经该预处理方法处理后,内层纤维环和上下端软骨终板没有明显结构性破坏,并且溶质分子更加容易扩散至椎间盘髓核组织。2.培养周期中,与对照组椎间盘相比,实验组椎间盘髓核组织细胞活力明显增高、胞外基质大分子的基因和蛋白表达升高、胞外基质降解酶的基因表达下调、髓核组织主要胞外基质组分的含量明显升高。3.培养14天后,与新鲜椎间盘比较时,实验组中椎间盘髓核组织在细胞活力和胞外基质代谢方面更加接近新鲜椎间盘髓核组织。第二部分1.椎间盘在不同葡萄糖水平、不同渗透压水平和不同血清水平培养7天后,发现高糖(4.5 g/L)、等渗(430 m Osm/kg)和10%血清的培养条件能较好地维持椎间盘髓核组织细胞活力、胞外基质大分子及基质降解酶抑制因子的基因表达、胞外基质主要生化组分(GAG和HYP)的含量,同时这些培养条件可一定程度上降低基质降解酶的基因表达。2.与新鲜髓核组织比较,椎间盘在该优化培养环境中(高糖、等渗、10%血清)培养14天后,髓核组织在细胞活力、细胞形态及分布、组织亲水性,和胞外基质合成代谢方面仍保持较好的生物活性。第三部分1.各压应力组间比较,在1.3 MPa组、5.0 Hz组和8 h组中,椎间盘髓核组织中细胞凋亡率明显增高,胞外基质大分子表达降低,基质降解酶的表达升高,髓核组织GAG的含量下降,髓核组织collagen II蛋白表达降低。2.与无压应力对照组比较,其他压应力大小(0.1-0.4 MPa)组、压应力频率(0.1-3.0Hz)组和压应力作用时间(1-4 h)组在髓核细胞活力、髓核组织胞外基质代谢相关分子的表达和髓核组织GAG含量上可保持相对“健康”的状态。第四部分1.髓核细胞三维培养模型和椎间盘器官培养模型中,相对于低负荷压应力组和对照组而言,高负荷压应力可增加髓核细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性,抑制髓核细胞增殖活性和端粒酶活性,上调衰老相关标志物(p16和p53)的表达,降低髓核细胞胞外基质生物合成能力。同时,高负荷压应力可显著增加胞内ROS蓄积,并增加p38 MAPK通路活性。2.髓核细胞三维培养模型中,在高负荷压应力下,加入ROS清除剂NAC后,发现衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低,髓核细胞增殖活性和端粒酶活性增加,衰老相关标志物(p16和p53)的表达下调,髓核细胞胞外基质生物合成能力也有增强。另外,NAC可有效地减少髓核细胞胞内ROS蓄积,但NAC对p38 MAPK通路的活性无明显影响。3.髓核细胞三维培养模型中,在高负荷压应力下,加入抑制剂SB203580抑制p38MAPK通路后,发现髓核细胞胞内ROS蓄积减少,衰老相关β-半乳糖苷酶活性和衰老相关标志物(p16和p53)的表达降低,髓核细胞增殖活性、端粒酶活性和髓核细胞胞外基质生物合成能力增加。第五部分1.相对于对照组和低负荷压应力组而言,高负荷压应力下髓核细胞凋亡率和Caspase 3活性明显增加,抗凋亡分子Bcl-2的表达降低,促凋亡分子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase 3)的表达增加。同时发现高负荷压应力下,N-CDH的表达和PI3K/Akt通路活性明显降低,但GSK-3β蛋白活性增强。2.高负荷压应力下,髓核细胞过表达N-CDH后,发现细胞凋亡率和Caspase 3活性降低、抗凋亡分子Bcl-2的表达升高,促凋亡分子(Bax和Caspase 3/Cleaved-caspase3)的表达下降,同时PI3K/Akt通路活性增加,但GSK-3β蛋白活性减弱。3.高负荷压应力下,LY294002抑制N-CDH过表达的髓核细胞中PI3K/Akt通路活性后,发现髓核细胞凋亡率和Caspase 3活性增加,抗凋亡分子Bcl-2的表达降低,促凋亡分子(Bax和Caspase 3/Cleaved-caspase 3)的表达增加。同时发现GSK-3β蛋白活性增强,但N-CDH的表达不受抑制剂LY294002的影响。结论1.本研究建立了一种椎间盘培养前预处理方法,该预处理方法可促进溶质分子扩散至椎间盘中央髓核髓核组织;在14天的离体椎间盘器官灌注培养周期中,该方法能保持较稳定的髓核细胞活力和胞外基质合成。2.本研究在智能化仿生组织培养系统的基础上,优化了椎间盘体外培养时的培养基条件,发现高糖(4.5 g/L)、等渗(430 m Osm/kg)和10%血清组合的优化培养条件能使椎间盘髓核组织保持与新鲜髓核组织相近的生物活性。3.本研究中证明高强度、高频率及长时间的压应力刺激均可促进离体椎间盘髓核组织中细胞凋亡并破坏胞外基质的自稳态;但一定范围的压应力大小(0.1-0.4 MPa)、压应力频率(0.1-3.0 Hz)和压应力作用时间(1-4 h)可使离体椎间盘髓核组织保持相对“健康”的生物活性。4.高负荷压应力可能通过激活p38 MAPK通路后增加胞内ROS蓄积,进而促进椎间盘髓核细胞衰老。这一机制可能是高负荷压应力加速椎间盘退变的可能途径。5.高负荷压应力可通过下调N-CDH表达降低PI3K/Akt通路活性,继而增加下游GSK-3β的活性,后者可促进髓核细胞经线粒体途径发生凋亡。这一机制可能是高负荷压应力加速椎间盘退变的另一可能途径。