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该研究利用原核(大肠杆菌)表达系统,成功表达了大鼠肝脏F抗原,表达产物经SDS-PAGE,Western-blot分析,分子量为43kD与报导一致,而其同时具有F抗原的免疫学活性,可作为一种成功的基因工程产品,用于今后F抗原的性质研究或作为一种抗原纯品为今后的免疫检测工作打好基础.主要研究内容及结果如下:1.基因克隆.提取大鼠肝脏总RNA,确定其纯度和完整性后对其进行反转录和PCR(RT-PCR)扩增出目的基因(F-antigens cDNA),然后将其与pUCm-T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T-F并转化到大肠杆菌DH5α中,测序结果与Gene-bank上提供的F抗原cDNA序列完全一致.2.蛋白表达.将测序结果正确的克隆片断重新与表达载体pET-15b连接,获得F抗原表达质粒pET15b-F并将其转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,用1mM IPTG诱导其表达,表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,目的带分子量大小约为43kD,与预期值相符,表达量可达全菌总蛋白量的40﹪.3.蛋白纯化和免疫检测.表达的目的蛋白绝大部分存在于包涵体沉淀中,对表达后的菌体进行超声裂解,释放包涵体后,对其进行初步纯化最后溶于8M尿素中,再用His-tag柱对其进行亲和层析纯化,经SDS-PAGE检测,纯化后得到了不含其他杂蛋白的单一F抗原条带.然后将过柱纯化后的F抗原与豚鼠抗大鼠F抗原多克隆抗血清反应成阳性,说明我们经基因工程方法得到的纯化的F抗原有免疫活性,可用于后续的实验研究.4.蛋白表达条件的研究.通过SDS-PAGE、成像分析、数据处理等手段测定大肠杆菌被诱导时的浓度、所加诱导剂IPTG的量以及表达时间的长短这些外部因素对原核表达系统中目的蛋白表达量的影响.以表达产物占菌体总蛋白的百分数作为表达效率来说明.通过对实验中所得到的数据的处理,最终确定实现外源基因的最大量表达所需要的外部条件为:当大肠杆菌OD<,600>值为0.4时加入1mMIPTG进行诱导6小时或以上,即可达到目的蛋白的最大量表达.