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目的: 肺癌是全球性的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。我国是肺癌的高发国家，肺癌在我国的肿瘤发病率和死亡率中均占第一位。由于肺癌具有较强的侵袭性及转移能力，一旦发生转移，肺癌患者将面临极高的死亡威胁，因此，有效控制肺癌转移是目前急需解决的问题。大量研究表明，肺癌的侵袭与转移与其所处的肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、间质细胞、细胞外基质及其特异的理化环境等组成，并且由于微环境中各个因素间的相互影响，相互作用，不断推动肿瘤的恶性化进展，最终导致肿瘤的侵袭和转移。因此，与单一的研究肺癌细胞相比较，研究肺癌及其微环境的相互关系，能更加全面的了解肺癌侵袭与转移的机制，为肺癌的治疗提供新方向。 目前，对肿瘤微环境的研究主要依赖于细胞实验、动物实验和临床样本的分析，但由于实验可靠性、伦理及实验样品来源稀缺等诸多方面的限制，我们迫切需要一种可以真实模拟体内肿瘤微环境的新方法来研究肿瘤转移的机制，而微流控芯片上细胞的三维培养为此提供了新平台。微流控芯片技术依托于微加工工艺，可实现样品的采集、分离、纯化、检测及结果判读等实验流程的一体化和自动化，同时因其具有高通量、操控性及灵活性强、成本低等优点，在肿瘤研究中发挥着越来越重要的作用。 本研究拟利用微流控芯片技术，构建集成化的仿生肺癌模型，用于共培养肺癌细胞和巨噬细胞，观察两者相互作用下的细胞表型变化，并在显微镜下实时观测肺癌细胞在肿瘤相关的M2型巨噬细胞作用下的侵袭过程，然后通过蛋白质组学技术和生物信息学技术高通量筛选受巨噬细胞刺激，发生上皮间质转化前后的肺癌细胞中的关键蛋白，再进一步研究肿瘤相关的M2型巨噬细胞引起肺癌细胞侵袭和转移的相关机制，以期望为肺癌的治疗找到新的药物靶点，并为微流控芯片仿生平台在肺癌微环境中相关分子机制研究的可靠性提供了新的依据。本研究分为以下三部分。 方法: 1.微流控芯片仿生肺癌模型的构建 利用微流控芯片技术，构建一个集成化的芯片仿生肺癌模型。利用细胞三维培养和气液双相培养技术，共培养肺癌细胞与巨噬细胞，分别检测肺癌细胞的上皮间质转化和巨噬细胞的M2型分化，并在芯片上实时观察发生上皮细胞间质转化的肺癌细胞在共培养分泌液的趋化作用下的侵袭过程。同时，利用传统的Transwell共培养实验和侵袭实验对芯片平台上的结果进行验证。 2.应用蛋白质组学技术筛选与肺癌细胞的侵袭与转移相关的关键蛋白 利用同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ）高通量对比受巨噬细胞刺激，发生上皮间质转化前后的肺癌细胞中的关键蛋白;接着通过对表达量有显著差异的蛋白进行生物信息学分析，主要通过GO-BP富集图信息、蛋白互作网络数据、富集的KEGG通路统计等综合分析后，进一步筛选与肺癌侵袭和转移有关的关键蛋白，为研究肺癌的侵袭及转移过程中，肺癌细胞与巨噬细胞相互影响的关键分子及可能机制提供依据。 3.肺癌细胞的侵袭与转移和巨噬细胞相互影响的关键蛋白验证性研究 通过蛋白质组学和生物信息学分析，筛选出CRYAB可能为与肺癌的侵袭和转移相关的关键蛋白，在通过敲低和过表达CRYAB的蛋白表达量，在微流控芯片、transwell平台和裸鼠成瘤模型中进一步研究CRYAB与肺癌侵袭转移的关系，以期通过微流控芯片技术和蛋白质组学技术相结合，为肿瘤微环境的研究开拓思路。 结果: 1.微流控芯片仿生肺癌模型的构建 本部分研究构建了微流控芯片仿生肺癌模型，成功进行了巨噬细胞和肺癌细胞的三维共培养，通过细胞活性及功能分析，发现该模型的气液双相培养模式适宜细胞生长。巨噬细胞和肺癌细胞A549共培养3天后，巨噬细胞高表达了与M2表型相关的CD206和F4/80蛋白，证明巨噬细胞向肿瘤相关的M2型巨噬细胞转化;而肺癌细胞的E-钙黏连蛋白表达量降低，N-钙黏连蛋白和Slug表达量增高，证明肺癌细胞的上皮细胞间质转化，并实时观测了肺癌细胞的侵袭过程，发现发生上皮细胞间质转化的肺癌细胞在共培养分泌液的刺激下，肺癌细胞侵袭的数量更多，迁移的距离更远。 2.应用蛋白质组学技术筛选与肺癌的侵袭与转移相关的关键蛋白 应用iTRAQ技术对受巨噬细胞刺激而发生上皮细胞间质转化的肺癌细胞前后的差异蛋白进行定量分析;然后结合本研究的方向，进行蛋白互作网络数据、GO-BP富集图信息、富集的KEGG通路统计等生物信息学分析，进一步筛选出前人研究较少，但可能与肺癌的侵袭和转移相关的关键蛋白CDK1、SIAH1、MAP4、CRYAB、FTH1、MCM4等，为后续研究肺癌的侵袭和转移过程中，肺癌细胞与微环境中巨噬细胞相互影响的关键蛋白及可能机制提供依据。 3.肺癌的侵袭与转移和巨噬细胞相互影响的关键蛋白的验证性研究 选取肺癌细胞中的关键分子CRYAB为代表，从微流控芯片仿生平台、transwell平台进行验证，发现下调CRYAB能有效降低肺癌细胞上皮细胞间质转化的能力，并进一步降低其侵袭能力;在动物模型的验证中，下调CRYAB降低了肺癌细胞的生长和转移能力，上调CRYAB则增加了其生长和转移能力。 结论: 1.本部分研究构建了微流控芯片仿生肺癌模型，验证了三维共培养条件下，巨噬细胞和肺癌细胞相互作用，促使巨噬细胞转化为肿瘤相关的M2型巨噬细胞，而肺癌细胞则发生上皮细胞间质转化，并使肺癌细胞具有更强的侵袭和迁移能力。为后续蛋白质组学筛选肺癌细胞中与侵袭和转移相关的关键蛋白及其验证性研究奠定了基础。 2.应用蛋白质组学技术筛选出了CDK1、SIAH1、MAP4、CRYAB、FTH1、MCM4等关键蛋白，这些肺癌细胞中的蛋白可能受巨噬细胞刺激而出现表达差异，并与肺癌的侵袭和转移密切相关，为后续分子机制的研究提供了依据。 3.从微流控芯片仿生肺癌模型、transwell平台和动物模型进行验证，发现CRYAB蛋白能有效影响肺癌细胞上皮细胞间质转化及侵袭和转移能力，有可能作为肺癌治疗的新靶点，并为微流控芯片仿生平台在肺癌微环境中相关分子机制研究的可靠性提供了新的依据。