PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

• 作 者: 刘宗争
• 机 构: 山东农业大学
• 出 处: 山东农业大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: ORF2 基因表达 免疫效力

猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type2, PCV-2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎和肾病综合症(PDNS)和猪呼吸道病复合征(PRDC)等多种疾病的主要病原之一。其流行广泛及造成的巨大经济损失,已引起世界养猪业的重视。PCV-2 ORF2编码的结构蛋白具有有型特异性抗原决定簇,因此它是区分PCV-1和PCV-2的重要抗原,它有望在血清学诊断中发挥作用。国内外研究证明,Cap蛋白可以诱导机体产生一定水平的抗体,对机体产生免疫保护作用,是构建重组疫苗和检测的首选基因。本研究通过PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中获得表达蛋白,采用不同剂量的表达蛋白和PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化配制疫苗,以猪作为动物模型,观察其免疫效果。试验一PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达根据已发表的PCV-2 ORF2基因序列,设计合成一对引物,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,获得一约531bp的特异性片段,与预期结果相符。经序列测定,其序列与目的基因序列一致。将PCR的扩增产物经酶切后连入pET-32a载体,构建重组质粒,证明成功构建了重组表达质粒pET32a-ORF2。筛选的阳性重组质粒pET32a-ORF2和空表达载体pET32a经PCR和酶切鉴定,经测序后,分别转化大肠杆菌BL21,用1 mmol/L的IPTG于37℃进行诱导表达,PCV-2 ORF2编码的蛋白片段在大肠杆菌E.coli BL21中以包涵体的形式得到大量表达。分别取诱导后1、2、3、4、5、6h后的诱导产物进行SDS-PAGE分析。分析证明诱导表达6 h内,蛋白表达量与随诱导时间增加而增加,在5h蛋白表达量达到最大值。表达产物经包涵体洗液纯化后,Western blot可见有特异性条带产生,获得了理想的纯化效果,表达的重组蛋白能被PCV-2的单克隆抗体所识别试验二表达的cap蛋白与PCV2灭活抗原免疫效果的比较将稀释至2.5mg/ml、1.25 mg/ml的表达蛋白和稀释至105TCID50/ml的PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化配制疫苗。将20头30日龄左右的PCV2抗体及抗原阴性的的仔猪随机分为4组,每组5头,分别肌肉注射以上三种配制的疫苗及PBS各2ml、。首免后3周加强免疫,加强免疫后3周攻毒。攻毒后分别在第4、7天用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)进行免疫刺激,并在攻毒后第4、7、11、19天用巯基乙酸培养基刺激,隔离饲养观察,30天后全部宰杀。首免后定期采血测其ELISA抗体水平、中和抗体水平,攻毒后通过临床表现及体温变化、相对日增重、病毒血症、排毒情况及解剖时的病理变化等指标评价疫苗效果。结果为：第一组刺激机体产生的ELISA抗体水平、中和抗体水平明显高于其他免疫组和攻毒对照组(P<0.01)。攻毒后,第一组仔猪在相对日增重高于其他各组(P<0.01),攻毒期间体内带毒和体外排毒的仔猪数量最少(各2头),带毒与排毒的持续时间最短(分别在第11天和第7天消失)；病理切片显微观察显示,攻毒后第一组的组织病理变化最为轻微。这些数据证明2.5mg/ml的表达蛋白配制的疫苗效果明显优于其他疫苗。