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动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死等重大致死性心血管疾病的病因,其病变基础是脂质的代谢障碍,其主要病理过程为：脂质和糖类代谢产物在动脉内膜沉积、炎性细胞浸润、纤维组织增生,进而引起动脉壁结构成分的改变。AS的发病机制并未完全明确。按照内皮损伤反应学说的解释,AS是一种慢性炎症性疾病,各种危险因素主要通过损伤动脉内膜而引起动脉壁乃至全身性的炎性反应,最终导致AS。AS的发生和演变过程与血管内皮细胞损伤后的功能紊乱和凋亡密切相关。因此,明确内皮细胞损伤的具体机制有助于AS的预防和治疗。内皮下的脂质及其各种修饰后的产物的沉积是动脉粥样硬化病变的一个重要病理特点。流行病学研究证实低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)是动脉粥样硬化的一个重要危险因素,其氧化产物——氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是AS发病过程中的一个关键成分。Ox-LDL通过多种机制作用于内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等细胞类型而在AS的发生、发展中发挥重要作用。众多危险因素尤其是ox-LDL引起的内皮细胞损伤和凋亡是动脉粥样硬化的初始环节。此外还有研究报道ox-LDL可损伤内皮祖细胞而影响内皮损伤后的修复。虽然研究者已经报道了内皮细胞损伤的诸多机制,但ox-LDL损伤内皮的作用机制特别是其中的信号转导与调控过程仍未完全明了,有必要进行进一步的研究阐明。在内皮细胞、平滑肌细胞(vascular smooth muscle,VSMC)、巨噬细胞等细胞表面有大量caveolae存在,而caveolin-1是这种特殊的胞膜凹陷样结构中的标志性蛋白。Caveolin-1广泛参与了细胞信号的转导和调控。研究表明caveolin-1在动脉粥样硬化发病过程中发挥着重要而又复杂的介导作用。Caveolin-1可以调节内皮细胞的通透性,参与LDL-C、ox-LDL的摄取和跨膜转运,并介导ox-LDL对内皮细胞的损伤。Caveolin-1还参与了内皮细胞增殖、迁移、细胞因子表达和新生血管形成等方面的调控。核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)在炎症、氧化应激、细胞增殖与凋亡等过程中发挥重要调控作用。免疫组化研究发现在动脉粥样硬化斑块处的多种细胞中都存在NF-κB的显著活化。NF-κB信号通路介导血管紧张素和脂质等危险因素的促动脉粥样硬化作用,参与单核细胞向内皮的粘附和迁移,调控血管内皮细胞增殖和凋亡,并在内皮细胞迁移和新生血管的形成中发挥重要作用。研究表明ox-LDL能够诱导内皮细胞中NF-κB的活化,而后者的活化介导了ox-LDL诱导的内皮细胞的激活、损伤及表面粘附分子表达的上调与巨噬细胞向损伤内皮的粘附。作为染色体结构中的重要成分,在生理状态下的细胞中,高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)主要定位于细胞核内。而作为一种晚期促炎症因子,HMGB1既能够由细胞主动分泌到胞外,也可由损伤、坏死或凋亡的细胞被动地释放到胞外。HMGB1在上调内皮细胞通透性,增加脂质渗透和炎性细胞浸润等方面发挥重要促进作用。动脉粥样硬化的多种危险因素均能促进VSMCs、内皮细胞、泡沫细胞、巨噬细胞等合成和释放HMGB1。而在这些细胞表面也有大量的HMGB1受体表达——在动脉粥样硬化病变处,HMGB1可以活化内皮细胞、VSMCs、炎性细胞和血小板,诱导细胞粘附分子表达上调及多种细胞因子的合成和释放,促进中性粒细胞、单核细胞的粘附和趋化以及VSMCs的迁移,放大炎症反应,加速动脉粥样硬化的进展。NF-κB是Caveolin-1的一个重要的下游信号分子,而Caveolin-1参与了NF-κB活化的调控。Caveolin-1/NF-κB信号通路也被证实参与了ox-LDL诱导的内皮损伤。也有研究证实caveolin-1和NF-κB参与调控多种细胞分泌HMGB1的过程。还有研究表明HMGB1可通过晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)、Toll样受体(toll-like receptor,TLRs)激活NF-κB,进而放大炎性反应。考虑到Caveolin-1、NF-κB和HMGB1之间的相关关系及其作用,我们推测Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路可能在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中发挥着重要作用。但目前少有相关的研究报道。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是单核造血干细胞中的一个重要的细胞亚群,在血管生发、内皮修复、血管再内皮化和抑制内膜增生等过程中发挥着重要作用。EPCs的损伤和功能紊乱可能参与了AS的发生和发展。研究发现高脂血症、动脉粥样硬化或冠心病患者循环血中EPC水平显著降低,但是具体机制尚未明确。Ox-LDL影响EPCs的存活、增殖、迁移和分化。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)在动脉粥样硬化的发展过程中发挥着关键作用。Ox-LDL能引起大量的ROS合成,并且ROS介导了ox-LDL对脐静脉内皮细胞、骨髓干细胞、VSMC、单核细胞和巨噬细胞的多种作用。Ox-LDL不仅能够显著诱导体外培养的内皮细胞中ROS的生成,而且参与了体内ROS的生成。在我们之前的研究也发现：经尾静脉注射外源性的ox-LDL能够显著促进小鼠骨髓和外周血中的ROS的生成。因此,ROS可能在ox-LDL诱导的EPC损伤中发挥重要的介导作用。但是在体内环境尤其是高脂血症情况下,ox-LDL影响外周血中EPC水平的具体机制尚未明确。普罗布考具有较强的抗氧化和抗炎作用,且能抑制动脉粥样硬化的进展和冠脉的再狭窄。有研究报道普罗布考通过增强前列环素的合成、降低内源性一氧化氮合酶抑制物的表达水平和阻断粘附分子的表达而保护内皮细胞。并且,普罗布考促进内皮细胞的增殖,抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋亡。Ox-LDL可经多种途径诱导巨噬细胞的凋亡,而普罗布考能够清除氧自由基而抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,减少粥样斑块脂质坏死核心的体积并稳定斑块。普罗布考对于内皮祖细胞也具有保护作用。比如吸烟能够抑制缺血诱导的血管新生功能,而普罗布考能通过改善EPCs的功能而改善血管新生。但目前尚未明确普罗布考能否在高脂血症患者体内保护EPCs免受由ox-LDL诱导的ROS生成带来的损伤。本研究目的在于观察Caveolin-1、NF-κB和HMGB1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用而进一步明确ox-LDL损伤内皮的机制,研究体内环境下ox-LDL诱导内皮祖细胞损伤的具体机制,并探讨普罗布考保护内皮祖细胞的可能机制。本研究分为以下两个部分：第一部分Caveolin-1/NF-KB/HMGB1信号通路在ox-LDL诱导内皮细胞损伤及巨噬细胞迁移中的作用目的：观察Caveolin-1、NF-κB和HMGB1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用而进一步明确ox-LDL损伤内皮的机制,并探讨该通路尤其是HMGB1在损伤内皮细胞诱导巨噬细胞迁移中的作用方法：1.在ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的实验中,将人脐静脉内皮细胞株CRL-1730细胞接种到细胞培养瓶中,在细胞生长至80%单层细胞融合时,对细胞进行分组并以不同浓度的ox-LDL处理内皮细胞来构建内皮细胞损伤模型。实验组的ox-LDL浓度梯度分别为10、20、40μg/ml,而以同等体积的PBS处理内皮细胞作为对照组。加入ox-LDL或者PBS后的内皮细胞孵育24h后,按照相应的要求分别提取细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞核蛋白和细胞总蛋白,并通过Western Blot检测蛋白提取物中caveolin-1和NF-κB p65的表达和磷酸化水平与细胞色素C (cytochrome C,Cyt C)C和HMGB1在细胞内的分布。2.在siRNAs转染实验中,将HUVECs接种于6孔板内(2×105个/孔),每孔中加入2ml含10%胎牛血清、不含双抗的培养基,培养至约50%单层细胞融合时洗涤细胞,然后分别加入按照要求配制好的si-Cav1、si-p65或si-HMGB1,孵育12h后向各试验组中加入ox-LDL(终浓度为40μg/ml)处理内皮细胞。再孵育24h后,离心后收集细胞,按照相应的要求提取细胞总蛋白和细胞浆蛋白,并通过Western Blot检测细胞总蛋白中caveolin-1和NF-κB p65的表达和磷酸化水平、细胞浆蛋白中Cyt C的表达水平、细胞总蛋白中Pro-caspase-3和剪切活化后的caspase-3的表达水平与细胞总蛋白和胞浆蛋白中HMGB1的表达水平。我们还收集了各组细胞的培养基,经离心后获得细胞培养基上清液,并以Western Blot检测了由内皮细胞释放到胞外的HMGB1的相对水平。3.在细胞凋亡实验中,用si-Cav1、si-p65和si-HMGB1以上面介绍过的步骤分别转染HUVECs沉默相应蛋白后再以ox-LDL(终浓度为40μg/ml)处理转染后的各组HUVECs 24h。向另一组HUVECs加入同等体积的PBS作为对照组。以Annexin V和PI双标染色,通过流式细胞术检测各组内皮细胞的凋亡水平。4.在细胞免疫荧光实验中,我们将dil标记的ox-LDL以40μg/ml终浓度加入分别转染si-Cav1、si-p65或si-HMGB1后的各组HUVECs培养基中,避光孵育6h后吸去培养基,PBS漂洗,以4%多聚甲醛室温下固定细胞,用3%的Triton-X100室温下破膜。以羊血清室温下封闭后,加入1：500兔抗人HMGB1单抗在4℃下孵育过夜,然后加入1：20的FITC标记的羊抗兔的荧光二抗在37℃下孵育45min,以PBS漂洗后应用抗荧光淬灭封片液封片,在暗室中分别以490/525nm、550nm/565nm为激发光／滤光频率在荧光显微镜下观察。每张玻片同取200倍数放大,取5个不同视野,观察HUVECs内ox-LDL的含量和HMGB1的表达。5.在巨噬细胞迁移试验中,首先用Ficoll密度梯度离心法从采自健康志愿者的空腹外周静脉血中分离人外周血单核细胞。重悬单核细胞后接种于细胞培养板中,并加入终浓度为50ng/ml的巨噬细胞刺激因子(M-CSF),于37℃、5%C02的细胞培养箱中培养7天。期间两次半量换液并加入全量的M-CSF。培养7天后,以DAPI和FITC标记的CD14染色后荧光显微镜下观察细胞形态,并以流式细胞术鉴定单核细胞向巨噬细胞的分化。将经过鉴定的、分化良好的巨噬细胞接种于Transwell小室的上室中,下室中分别加入500ul前面已经制备好的各组HUVECs的培养基上清液,孵育48h。取出小室,擦去上室内细胞后以0.1%结晶紫染色,镜下随机计数5个视野中迁移到下室的巨噬细胞。6.数据以均数±标准差的形式来表示。实验数据用SPSS17.0统计软件进行统计分析。多组间的差异以单因素方差分析进行检验,两组间数据以非配对t检验进行比较分析,取p<0.05(双侧)为差异具有统计学意义。结果：1. Ox-LDL以浓度依赖的方式上调caveolin-1的表达和磷酸化水平,促进NF-κBp65的磷酸化和Cyt C由线粒体向细胞浆的释放,并上调HMGB1在细胞浆内表达水平而下调HMGB1的胞核内表达水平。2. Ox-LDL引起HUVECs内caveolin-1/NF-κB/HMGB 1信号通路的显著激活：ox-LDL诱导caveolin-1的表达及磷酸化水平上调,然后磷酸化激活NF-κB,继而上调HMGB1的表达及其由胞核向胞浆内的迁移;caveolin-1表达和磷酸化的上调激活的NF-κB反过来进一步上调caveolin-1的表达和磷酸化。3. Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路在ox-LDL诱导的HUVECs损伤和凋亡中发挥着重要作用：敲除caveolin-1可以显著抑制ox-LDL诱导的HUVECs内的线粒体损伤和HUVECs的凋亡；敲除NF-κB p65可以显著阻断ox-LDL诱导的线粒体损伤、caspase-3的活化和HUVECs的凋亡；在ox-LDL处理之前,抑制HMGB1的表达显著引起HUVECs中线粒体的损伤；但是,在ox-LDL刺激后,敲除HMGB1显著上调ox-LDL诱导的HUVECs内的线粒体损伤、caspase-3剪切活化和HUVECs的凋亡。4. Caveolin-1、NF-κB、HMGB 1在内皮细胞摄取ox-LDL的过程中发挥着重要的调节作用：ox-LDL可以诱导HUVECs摄取ox-LDL和HUVECs内HMGB1的表达；caveolin-1和NF-κB p65的沉默可显著抑制HUVECs对ox-LDL的摄取和ox-LDL诱导的HMGB1在HUVECs内的表达;而沉默HMGB1显著促进了HUVECs对ox-LDL的摄取。5. Caveolin-1/NF-κB/HMGB 1通路在损伤内皮诱导巨噬细胞迁移中发挥重要作用,但HMGB1可能并非损伤HUVECs直接诱导巨噬细胞迁移的主要影响因子：ox-LDL显著促进了HUVECs释放HMGB1;在ox-LDL刺激前后,siRNAs分别沉默HUVECs内caveolin-1、NF-κB p65和HMGB1的表达均可显著抑制HMGB1的释放；但HMGB1水平与巨噬细胞迁移实验的结果并不完全一致——ox-LDL处理前后,si-HMGB1沉默HUVECs内的HMGB1的表达后均显著下调了HMGB1的释放,但在ox-LDL作用于si-HMGB 1转染后的HUVECs后,培养基上清液中HMGB1水平未有显著升高的同时伴有巨噬细胞迁移显著增加。结论：Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路在内皮细胞摄取ox-LDL及ox-LDL诱导HUVECs损伤过程中发挥着重要作用。Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路参与了损伤内皮诱导巨噬细胞迁移的过程,但损伤内皮细胞释放的HMGB1并未直接在诱导巨噬细胞迁移中发挥主要作用。第二部分Ox-LDL损伤在体内皮祖细胞及普罗布考在高脂血症中保护内皮祖细胞的机制目的：探讨体内环境下ox-LDL损伤内皮祖细胞的机制及普罗布考在高脂血症中保护内皮祖细胞的可能机制。方法：1.动物研究部分1.1制备ox-LDL抽取健康志愿者的10ml外周静脉血,置于肝素化的离心管中,以1500g离心20min收集血浆。以KBr将血浆密度调整至1.30g/ml,并铺设生理盐水层,以10℃、35000g离心60min,收集LDL。将LDL置于PBS中过夜透析。过滤后以Lowry法进行脂蛋白浓度定量后,以CuSO4氧化LDL-c,加入DETA溶液终止反应,即可获得ox-LDL溶液。1.2制备高脂血症模型将24只4-6周大的野生型雄性C57BL/6小鼠随机分入三组：对照组、ox-LDL组和普罗布考组。Ox-LDL组和普罗布考组小鼠均每日接受一次尾静脉注射50μg ox-LDL,连续3日,而对照组小鼠相应地接受同等体积的PBS注射。普罗布考组小鼠在接受ox-LDL处理前一天开始接受500mg/kg/d普罗布考灌胃,连续3日。灌胃前,首先将普罗布考溶于99%的乙醇溶液中,并进而以PBS稀释。1.3检测细胞内和细胞外的ROS水平小鼠经过尾静脉连续注射ox-LDL或者PBS 3日后,取血和骨髓,并收集到肝素化的试管内。用红细胞裂解液裂解红细胞,分别以流式细胞术或电子顺磁共振法检测外周血细胞内ROS生成与骨髓细胞外ROS生成水平。1.4检测小鼠骨髓中单个核细胞和外周血中EPC水平前面获取的小鼠血液、骨髓液以红细胞裂解液去除红细胞后,将骨髓液直接流式上机检测单个核细胞,血液加入相应抗体孵育后流式上机检测EPC。采用CD34+/Flk-1+组合来检测小鼠外周血中的EPC,以前向角散射光(Forward Scatter,FSC)和侧向角散射(Side Scatter,SSC)来筛选小鼠骨髓中的单个核细胞。2.临床研究部分签署知情同意书的10名合并高血脂的冠心病患者和5位年龄和性别匹配的健康志愿者纳入了研究。患者根据性别和年龄分层后随即分入普罗布考处理组和安慰剂组。2.1收集基线数据基线时,受试者空腹12h后抽取外周静脉血,通过电化学发光法检测患者的血脂、超氧化物歧化酶((superoxide dismutase,SOD)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平,以ELISA法检测患者血浆ox-LDL水平；在去除红细胞后以标志物组合CD34+/KDR+来标记人外周血中的EPC,经流式细胞术检测人外周血中EPC水平。2.2药物治疗普罗布考组和安慰剂组分别接受普罗布考500mg或安慰剂每日两次口服治疗,连续7日。过程中,采用双盲的方式减少偏倚。2.3收集治疗后数据7日治疗结束后,再次抽取受试者的空腹外周静脉血,并检测血脂、ox-LDL、 CRP、SOD以及外周血EPC水平。2.4收集停药后数据停药7日后,重复抽取受试者空腹12h后的外周静脉血,并再次进行相应的检测。3.数据分析数据以均值±标准差来表示,以非配对t检验来比较2组数据,以双变量方差分析来比较3组间是否存在显著性差异。以Shapiro-Wilk W-test来检验数据是否为正态分布,以F-检验来检验方差齐。如果数据为非正态分布或者方差不齐时使用非参数Mann-Whitney U-test来比较数据。以P<0.05(双侧)为差异存在统计学意义。结果：1.普罗布考阻断ox-LDL诱导的骨髓单个核细胞的减少和外周血中的EPCs水平。2.普罗布考削弱了ox-LDL诱导的细胞内外的ROS的生成。3.普罗布考降低了高脂血症患者血清中的ox-LDL水平,而上调外周血中的EPCs水平。4.普罗布考增加高脂血症患者外周血血浆中的SOD水平而降低CRP水平。结论：在体内,ox-LDL诱导的氧化应激参与了内皮祖细胞的损伤。通过抑制骨髓、外周血中细胞外ROS的生成和外周血中细胞内ROS的生成,普罗布考能够有效地阻断ox-LDL对外周血内皮祖细胞及骨髓单个核细胞损伤。临床试验中,普罗布考部分地逆转了高脂血症患者外周血中内皮祖细胞的减少。这种保护作用可能与普罗布考降低高脂血症患者体内ox-LDL和C反应蛋白的水平而增加SOD水平有关。