论文部分内容阅读
植物NAC转录因子是植物中所特有的一类转录因子,参与植物基因多种途径的表达调控,在植物对外界的生物与非生物的胁迫应答中起到关键的调控作用。菊花是中国传统名花,品种繁多,但在逆境如低温、干旱、盐碱等胁迫下,往往限制了其生长和观赏价值。因此培育抗逆性强的菊花新品种非常必要,但由于复杂的遗传背景,使菊花的抗逆性研究进展缓慢。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino]是菊科菊属的二倍体植物,遗传背景简单,且具有较强的耐盐碱能力。本试验从甘菊中分离了2个NAC转录因子基因的cDNA全长,并对该基因进行生物信息学分析与表达模式分析,并转入拟南芥中对其功能进行分析,以此来探讨甘菊中NAC转录因子基因的表达模式与功能,然后将该基因转入菊花品种----露地菊‘纽9717’中,进一步研究甘菊NAC基因的功能,以期能了解甘菊中NAC转录因子的作用机制及为培育抗逆性强的菊花新品系提供理论基础。主要研究结果如下：1.在课题组前期构建的甘菊转录组数据库中搜索NAC转录因子基因的ESTs,采用RACE技术分别扩增得到全长为881bp和1188bp的甘菊NAC基因cDNA序列ClNAC9和ClNAC39;其中ClNAC9具有一个651bp的ORF,编码217个氨基酸残基；ClNAC39基因具有一个849bp的ORF,编码283个氨基酸。保守结构域检索及氨基酸序列比对结果显示,这2个基因都具NAM结构域,是NAC转录因子家族的成员,其中ClNAC9基因属于SENU5亚家族；ClNAC39基因属于NAP亚家族,二者都是疏水性蛋白质。2.采用qRT-PCR分析ClNAC在不同非生物胁迫和激素处理的表达模式。结果表明：ClNAC9基因受高盐、干旱、热、ABA胁迫的诱导,不受冷及水杨酸胁迫诱导；ClNAC39基因受高盐、干旱、热、ABA及水杨酸的胁迫诱导,只不受冷诱导。从基因表达量变化峰值上,CINAC9基因相对表达量明显高于ClNA3C9。3.构建植物表达载体pBI121-ClNAC9口pBI121-ClNAC39,采用农杆菌介导方法转化拟南芥(Col-0),经卡那霉素抗性筛选及RT-PCR鉴定转基因阳性苗。在NaCl、 NaHCO3及干旱三种胁迫下两种转基因植株在表型明显优于野生型；转基因植株的MDA含量都低于野生型植株,SOD、POD活力都高于野生型植株。实时定量PCR分析表明转ClNAC9及ClNAC39基因的拟南芥能够响应盐碱和干旱的胁迫,诱导下游与胁迫相关抗性基因表达,增强了转基因植株的抗逆性。同时转ClNAC9基因的拟南芥在表现及生理指标上都优于转ClNAC39基因的拟南芥。4.以露地菊‘纽9717’腋芽为外植体,建立其初始培养。通过研究各阶段影响再生诸因素的作用,建立了露地菊‘纽9717’腋芽增殖和叶盘愈伤组织再生两种途径的再生体系。腋芽增值系数达到3.2,愈伤组织诱导率达100%,分化率达92.%以上,生根率为100%,为露地菊‘纽9717’遗传转化建立的了高效稳定的叶盘再生体系。5.通过根癌农杆菌介导,建立了高效的露地菊‘纽9717’遗传转化体系：卡那霉素浓度10mg/L为叶片最佳的抗生素筛选浓度、8mg/L为转化苗生根的最佳选择压力；叶片预培养时间为2-3d；菌液浓度为OD600为0.6左右；侵染时间为15min或OD600为0.8侵染10min共培养时间为2d,延迟培养3d。经PCR检测,得到了转CkNAC9基因的露地菊‘纽9717’植株15株及转ClNAC39基因的露地菊‘纽9717’植株4株。经RT-PCR再次检测,所检测植株都为阳性植株,可以选择进行下一步试验。