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目的原发性肝细胞癌(HCC)是一种复杂的高度恶性的慢性肝脏疾病,由于缺乏及时有效的诊断及治疗,使其成为世界范围内癌症死亡的第三大原因。尽管近年来涌现出许多新的治疗手段,但肿瘤细胞在肝脏内外的转移及侵袭仍然是病人死亡的主要原因。高迁移率族蛋白B1(HMGB1),不仅是一种高度保守的细胞核蛋白,在核内促进多种基因的转录,同时也是一种细胞外信号传导分子,由坏死的细胞或者炎症细胞分泌释放。近年来的研究发现,HMGB1在肿瘤发生发展的各个过程中都发挥着重要作用。作为唯一一个在绝大部分癌症中都过表达的miRNA, miR-21被认为是一种致癌微小RNA (oncomir)。虽然HMGB1与miR-21这两种致癌基因的过表达在多种癌症中已分别被广泛报道,但二者之间的关系及一些共同通路却鲜见报道。本课题旨在研究肝癌中异常表达的HMGB1对在多数癌症中高表达的m i R-21的正向调控作用,来阐述肝细胞癌形成后进展的潜在的分子生物学机制,进而为肝细胞癌复发的预防和治疗提供新的策略。方法利用肝癌细胞与重组人HMGB1蛋白的共培养实验,我们确定了外源性HMGB1对肝癌细胞中miR-21表达的时间及剂量依赖性。通过HMGB1中和抗体,IL6, IL6R及stat3抑制实验,检测miR-21的表达,stat3的活化,I L6的释放,包括Western blot,免疫荧光技术检测stat3以及stat3磷酸化位点tyr705的表达及转位、Elisa实验检测IL6在细胞培养液的释放等方法,我们进一步验证了HMGB1对miR-21表达调控对IL6/stat3通路的依赖性。通过生物信息学网站(TargetScan, miRBase及PicTar等网站)的靶点预测技术,Luc iferase荧光素酶精确靶点验证,Westernblot分析,SYBR Green定量PCR等实验方法,从多方面证实了miR-21对基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂的负向调控。最后,采用肝细胞癌裸鼠移植瘤模型,在动物体内证实,阻断miR-21对HMGB1过表达诱导的肝细胞癌的发生发展的抑制作用。结果在肝癌细胞中外源性人重组HMGB1可通过上调miR-21的表达进而促进肝癌的生长及进展。其对miR-21表达的调控表现为剂量和时间的依赖性,分别设置0.5ug/ml,1ug/ml,2ug/ml不同的剂量浓度,随着剂量的增加,miR-21的表达呈上升趋势,选择1ug/mI作为最佳刺激浓度,分别与肝癌细胞共培养不同的时间长度：0h,1h,3h,6h,12h,24h,随着共培养时间的延长,miR-21的表达升高,在24h时达到最高。通过加入HMGB1, IL6及IL6R中和抗体,和stat3抑制剂,证明HMGB1对miR-21表达的调控是IL6/stat3通路依赖性的。即在肝癌细胞中,外源性HMGB1对m i R-21表达的刺激不是直接作用的,而是通过一些相关的信号通路介导的相关的炎症通路调控的。在本课题中,通过精确靶点验证实验(即Iuciferase assay)证实,通过对预测靶点RECCK和TIMP33’UTR区域的直接绑定,miR-21可以对二者进行负性调控在HMGB1过表达的肝癌细胞中,抑制miR-21的表达,或者利用stat3抑制剂与肝癌细胞共培养,均可以在很大程度上抑制肿瘤细胞的转移和侵袭能力。体内实验显示,在HMGB1过表达的裸鼠肝癌移植瘤模型中,细胞成瘤的速度及肿瘤的大小明显高于对照组,瘤内注射miR-21抑制剂,肿瘤的大小明显减小,生长的速度明显减慢,活体成像实验表明,miR-21抑制剂的瘤内注射,使HMGB1过表达组的MMPs活性明显降低,进而抑制肝癌的进展。结论体外与体内实验都提示,HMGB1对miR-21表达的调控是IL6/stat3通路依赖性的,并且miR-21是HMGB1下游一个重要的分子,在HMGB1过表达引起的肿瘤的发生及进展中发挥着至关重要的作用。MiR-21抑制剂通过靶向关键性MMPs抑制剂RECK和TIMP3,抑制了MMPs的活性表达,进而抑制HMGB1诱导的肝癌的发生发展。我们的研究提示,通过对miR-21的调控来干预HMGB1过表达引起的肿瘤的发生及进展有望成为一种潜在的抗肝癌的新策略。