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目的:胶质母细胞瘤是常见的脑原发性恶性肿瘤,具有发病率、病死率、复发率高及治愈率低的“三高一低”特点,即使采取胶质瘤标准化治疗方案—手术尽可能全切辅助放射治疗(分割或/和标准脑部放疗)和(或)替莫唑胺等药物治疗,中位生存时间仍不足15个月,对胶质瘤尤其是高级别胶质瘤患者预后无明显改善。随着分子生物学和遗传学水平的发展,越来越多的能够预测患者预后及治疗反应的分子标记被发现。NUPR1(p8/Com1)最早在研究胰腺应激性损伤机制时发现,近来,相关研究显示在包括消化系统、呼吸系统、内分泌系统、泌尿系统、生殖系统及血液系统等肿瘤组织中异常表达,与恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学功能调控相关。所以,本课题旨在探究NUPR1在人胶质母细胞瘤组织中的表达情况,与患者预后和胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移、周期、凋亡及体内成瘤有无相关性,及其相关的分子作用机制,为胶质母细胞瘤的诊断和预后寻找出一新的分子标记物,为胶质母细胞瘤的基因靶向治疗提供一个新方向和依据。方法:1.NUPR1在人胶质母细胞瘤组织中的表达情况及与临床病理因素的相关性:(1)收集大连医科大学附属第一医院神经外科2004年7月-2009年7月收治并术后病理确诊为胶质瘤122例组织蜡块标本,并收集2013年-2016年收治的30例胶质母细胞瘤和15例正常脑组织,液氮及-80°冰箱保存。根据WHO分级对肿瘤组织进行分级,整理临床病理资料,对所有的患者进行随访;(2)通过实时定量PCR、Western Blot等实验方法检测NUPR1在新鲜肿瘤组织和正常脑组织标本中的表达差异;(3)通过免疫组织化学方法对NUPR1在肿瘤和正常脑组织中进行定量和定位分子,并统计分析NUPR1表达与临床病理因素,同时进行COX单因素和多因素生存分析。2.体外实验中,NUPR1在胶质母细胞瘤细胞系中的生物功能分析:(1)实时定量PCR检测细胞系中NUPR1表达情况,选取U251和U87细胞进行后续试验,通过慢病毒转染细胞U251和U87建立NUPR1低表达稳转细胞系sh NUPR1,Western blot、实时定量PCR检测细胞转染效率。(2)通过细胞MTT增殖实验、细胞计数实验、Brd U实验检测sh Ctrl组细胞和敲低组sh NUPR1细胞的增殖能力;(3)通过流式细胞仪实验检测细胞周期及细胞凋亡的变化,从而观察NUPR1基因对U251和U87的细胞周期和凋亡的影响;(4)通过细胞划痕实验检测NUPR1基因对胶质母细胞瘤细胞U251和U87迁移情况的影响。3.体内实验中,采用裸鼠成瘤实验:(1)稳转细胞系建立成功后,裸鼠腋窝皮下种植对照组和敲低组细胞系,每日观察并记录肿瘤体积质量变化,从而检测细胞体内成瘤情况及增殖能力;(2)免疫组化实验、蛋白印记实验、实时定量PCR实验分别检测NUPR1在体内肿瘤中的表达情况。4.NUPR1的作用机制研究:(1)通过Western blot实验检测sh Ctrl及sh NUPR1细胞中周期相关蛋白表达情况;(2)通过蛋白质芯片技术检测sh Ctrl及sh NUPR1细胞中影响增殖关键蛋白表达情况,并采用Western blot实验进行验证,免疫双标实验检测NUPR1与差异蛋白的相关性。结果:1.NUPR1基因在胶质母细胞瘤组织中的表达高于正常脑组织通过实时荧光定量PCR实验检测收集的30例新鲜胶质母细胞瘤和15例正常脑组织中NUPR1表达情况,结果表明NUPR1基因m RNA水平在胶质母细胞瘤组织中的表达高于正常脑组织(P<0.05)。同样,Western blot实验结果显示6例胶质母细胞瘤组织中NUPR1蛋白含量高于4例正常脑组织。免疫组化结果显示在122例胶质母细胞瘤中,阳性表达NUPR1基因的例数为74例,占样本数的60.7%,低表达的例数为48例,占样本数的39.3%(P=0.009)。2.NUPR1基因表达与胶质瘤病理级别相关通过免疫组化方法对NUPR1在肿瘤和正常脑组织中进行定量和定位分析,并统计分析患者的性别、年龄、肿瘤位置、最大直径、切除情况及WHO肿瘤分级与NUPR1表达相关性,结果显示NUPR1基因定位于细胞核及胞浆中,年龄不小于50岁患者中,NUPR1阳性表达的例数为43例(69.4%),小于50岁患者中NUPR1阳性表达的例数为31例(51.7%),P=0.063;女性患者中,阳性表达的例数为29例(占59.2%);男性患者中,阳性表达的例数为45例(占61.6%),P=0.785;肿瘤最大直径大于等于5cm患者中阳性表达的例数为33例(占62.3%),肿瘤最大直径小于5cm患者中阳性表达的例数为41例(占59.4%),P=0.750;肿瘤位于小脑的患者中阳性表达的例数为3例(33.3%),位于额颞叶患者中阳性表达的例数为51例(62.2%),位于顶枕叶患者中阳性表达的例数为11例(57.9%),位于侧脑室的患者中阳性表达的例数为9例(75.0%),P=0.262;低级别胶质瘤(WHO I/II)患者中阳性表达的例数为3例(17.6%),高级别胶质瘤(WHO III/IV)患者中阳性表达的例数为71例(67.6%),P<0.001。说明NUPR1蛋白的表达随着WHO的临床病理级别的增髙而有升高趋势,NUPR1在恶性胶质瘤发生发展中发挥重要作用。3.NUPR1基因表达影响胶质细胞瘤患者预后通过对患者的年龄、性别、肿瘤位置、最大直径、切除情况、WHO肿瘤分级、术后KPS评分,术后是否放化疗及NUPR1的表达情况进行Log-rank生存分析,发现年龄≥50岁、高级别胶质瘤、高表达NUPR1水平的患者中位生存时间显著降低。COX单因素和多因素分析,发现高表达NUPR1的胶质瘤患者预后相比于低表达患者的预后差(P<0.024),从而证明NUPR1能够作为预测胶质瘤患者预后的分子标记物。4.稳转细胞系U251和U87的建立和鉴定慢病毒构建成功后,转染U251和U87细胞,免疫荧光、实时定量PCR及免疫印迹实验结果显示,免疫荧光标记的转染细胞数超过视野的80%以上,sh NUPR1组细胞的NUPR1 m RNA及蛋白表达水平分别比对照组sh Ctrl细胞均显著降低,从而证明了敲低NUPR1基因水平的U251和U87细胞模型建立成功。5.低表达NUPR1抑制U251和U87细胞的迁移能力通过细胞划痕实验研究NUPR1对细胞迁移能力的影响,划痕实验结果显示:与对照组sh Ctrl细胞相比,敲低NUPR1基因表达水平明显U251和U87抑制细胞的迁移速度和数量。6.低表达NUPR1抑制U251和U87细胞的增殖能力体外实验中,细胞MTT检测结果表明:相比对照组sh Ctrl,NUPR1敲减组U251和U87细胞增殖减缓(3-5天,P<0.001);细胞荧光计数实验结果显示:NUPR1敲减组与sh Ctrl组相比,细胞的存活率抑制明显(P<0.001);Brd U实验检测结果显示:相比对照组sh Ctrl,NUPR1敲减组U251和U87细胞增殖减缓(第4天,P<0.05)。体内裸鼠成瘤试验中,与对照组sh Ctrl细胞相比,NUPR1敲减组U87细胞的裸鼠荷瘤体积显著减小,减缓肿瘤的成瘤进程,证明低表达NUPR1抑制细胞增殖。综上实验结果证明敲低NUPR1基因表达明显抑制胶质母细胞瘤细胞增殖能力。7.低表达NUPR1介导P27阻滞细胞周期G0/G1期流式细胞实验检测对照组和敲低组U251和U87细胞周期分布,结果显示与对照组sh Ctrl相比,NUPR1敲低组U251和U87细胞周期G0/G1期(U251:平均48.36%vs.39.74%,U87:平均46.75%vs.36.63%,P<0.001),而S和G2期细胞比例分别为U251:36.65%vs.40.59%和15.41%vs.19.67%;U87:37.8%vs.41.79%和20.67%vs.21.58%(P<0.05),证明低表达NUPR1阻滞细胞周期G0/G1期。Western blot实验检测两组细胞中的周期相关蛋白表达情况,结果显示:相比于sh Ctrl组细胞,sh NUPR1组细胞中P27高表达,而CDK2、Cyclin E表达下降。免疫组化检测胶质瘤组织中P27、CDK2及Cyclin E表达情况,结果显示随着胶质瘤WHO级别的升高,P27表达呈现下降趋势,CDK2及Cyclin E高表达趋势,胶质母细胞瘤组织P27低表达。裸鼠荷瘤组织的免疫组化实验结果显示sh NUPR1组细胞中P27高表达。从而证明,NUPR1介导P27阻滞细胞周期G0/G1期。8.低表达NUPR1促进U251和U87细胞凋亡流式细胞实验检测对照组和敲低组U251和U87细胞凋亡数,sh Ctrl组U251细胞凋亡比例3.08%,sh NUPR1组U251细胞凋亡比例12.0%(U87:6.05%vs 2.34%),结果证明低表达NUPR1促进U251和U87细胞凋亡。9.NUPR1通过ERK、P38MAPK信号通路影响U251和U87细胞增殖蛋白质芯片技术检测sh Ctrl及sh NUPR1细胞中影响增殖关键蛋白,Western blot实验进行验证,结果显示低表达NUPR1组细胞中p-ERK(ERK1/2,Thr202/Try204)、p-P38(Thr180/Try182)呈现低表达水平,而p53、总ERK1/2、P38表达量无变化。对胶质母细胞瘤组织和正常脑组织进行免疫荧光双标实验,结果显示NUPR1分别与p-ERK、p-P38共表达。说明干扰NUPR1基因后对U251和U87细胞产生的抑制功能很可能是通过抑制ERK和P38的磷酸化来实现的。结论:1.NUPR1在胶质母细胞瘤组织中高表达,其表达水平与胶质瘤的病理分级及预后显著相关;2.干扰NUPR1基因影响胶质母细胞瘤的增殖、迁移能力;3.干扰NUPR1基因降低裸鼠体内荷瘤的增殖能力;4.干扰NUPR1基因通过上调细胞周期抑制蛋白p27抑制细胞周期G0/G1期,进而抑制胶母细胞瘤细胞增殖及细胞的迁移能力;5.NUPR1基因通过调节磷酸化ERK1/2、P38影响胶质母细胞瘤的增殖和凋亡;以上研究为胶质母细胞瘤的基因靶向治疗提供一个新方向和依据。