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[研究背景]益气解毒方对鼻咽癌细胞以及其裸鼠移植瘤均具有较强的抑制作用,联合运用顺铂能进一步增强其抑瘤率,有效提高荷瘤裸鼠治疗后的生存质量。益气解毒方可通过激活DC而增强T细胞的增殖反应,强化CTL对鼻咽癌靶细胞的杀伤活性。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的瘤细胞群体。尽管肿瘤干细胞数目很少,却具有强大的恶性增殖能力,决定了肿瘤生长速度及治疗后复发与转移潜能。若要彻底治愈肿瘤,必须清除这类细胞。迄今为止,研究鼻咽癌干细胞的报道却不多。miRNA是由一类内源性具有调控功能的非编码RNA,与靶基因的3’UTR区结合后,在转录后水平抑制蛋白的翻译而发挥负调控靶基因表达的作用。本课题运用益气解毒方药物血浆分别处理鼻咽癌干细胞CNE2-SC(CNE2-SC/QBTRF)和对照细胞CNE2-SC/control,然后进行miRNA芯片分析,筛选受益气解毒方调控的差异miRNA,从miRNA角度探讨益气解毒方杀灭鼻咽癌干细胞以及抑制鼻咽癌肿瘤生长增殖与侵袭的作用。[CD133和CD44在鼻咽癌不同临床进展阶段的表达分析]许多文献提示,CD133和CD44与多种肿瘤的发生有关,是多种肿瘤干细胞的标志物。因此,我们选择这两个肿瘤干细胞标志物在鼻咽癌组织和细胞中的表达活性进行验证与分析。首先采用免疫组化分析CD133、CD44在鼻咽癌组织中的表达活性改变与鼻咽癌临床进展阶段的相关性。结果显示,CD133和CD44在鼻咽癌肿瘤组织中的表达明显高于正常鼻咽上皮,且与临床分期相关。紧接着,运用流式细胞术与干细胞成球实验检测益气解毒方对肿瘤干细胞标志物CD133、CD44的表达活性的影响以及对鼻咽癌干细胞CNE2-SC的杀伤作用。结果显示,益气解毒方可显著抑制鼻咽癌干细胞CNE2-SC的成球能力,并下调CD133的表达水平,但对CD44表达活性无显著作用。[益气解毒方调控的差异miRNA在鼻咽癌组织和细胞中的表达活性检测]miRNA芯片结果经qRT-PCR验证发现,益气解毒方处理鼻咽癌干细胞CNE2-SC后,表达活性上调2倍以上的miRNA有4个(miR-200b, miR-29b, miR-34a, miR-101).运用qRT-PCR检测益气解毒方上调的miRNA在鼻咽癌细胞中的表达,以正常鼻咽上皮细胞NP-69为对照,结果显示,miR-200b在鼻咽癌CNE2、CNE1、6-10B、5-8F细胞中的表达活性都出现下调,且miR-200b在鼻咽癌干细胞CNE2-SC几乎不表达。于是选择miR-200b在53例鼻咽癌组织中进行进一步验证。qRT-PCR结果显示,miR-200b在鼻咽癌组织中表达显著下调,且随着鼻咽癌的临床进展而进一步下调。这些结果提示,miR-200b可能作为抑瘤miRNA参与鼻咽癌的发生发展过程。体内实验也证实,益气解毒方可显著上调CNE2鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤组织中miR-200b的表达水平。因此,益气解毒方可能通过上调miR-200b的表达杀灭肿瘤干细胞,进而抑制鼻咽癌的生长增殖速度与侵袭潜能。[miR-200b是鼻咽癌治疗的潜在生物靶点,miR-200b通过抑制靶基因CD133杀灭鼻咽癌干细胞,抑制鼻咽癌细胞的生长增殖与侵袭潜能,对鼻咽癌的发生发展过程发挥重要的影响]miRNA在肿瘤的发生发展中可充当抑瘤基因的作用。干细胞成球实验证实,miR-200b能抑制鼻咽癌干细胞CNE2-SC的成球能力。MTT、Transwell等实验证实,miR-200b可以抑制鼻咽癌细胞的生长、迁徙和侵袭能力,而干扰miR-200b则能促进鼻咽癌细胞的生长、运动和侵袭能力；体内实验表明,miR-200b可以抑制CNE2鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长速率；因而,miR-200b在鼻咽癌的发生发展过程中可能发挥抑瘤基因的作用。为进一步阐明其作用机制,我们运用生物信息学以及相应实验证实,miR-200b可抑制靶基因CD133的表达,并能下调鼻咽癌干细胞CNE2-SC中CD133的表达活性水平；而干扰miR-200b则能拮抗益气解毒方对鼻咽癌细胞的抑制效应。因此,miR-200b可能是鼻咽癌治疗的潜在生物靶点。总之,鼻咽癌的发生发展是一个多基因参与、多阶段变异累积形成的病理过程。miRNA、基因、肿瘤干细胞等在鼻咽癌的发生发展过程中扮演重要角色,它们相互作用,进而构成鼻咽癌发生发展过程中的复杂的调控网路。阐明益气解毒方通过miR-200b参与鼻咽癌发生发展的分子机制,能为鼻咽癌的诊断、预后评估提供检测分子标记,为鼻咽癌的临床治疗提供有效靶点。