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目的通过分离培养及鉴定新生SD乳鼠NSCs,建立缺氧NSCs模型,以氯化锂作为干预措施,探讨锂是否通过PI3K/Akt信号通路调控缺氧NSCs增殖,为临床应用锂治疗HIBD提供更有力的实验和理论证据。方法1.NSCs分离、培养及鉴定:脱颈处死新生1天内SD乳鼠,75%酒精浸泡消毒,分离海马组织,剔除脑膜及血管,平衡盐溶液冲洗,剪碎海马组织,0.25%胰酶消化后离心,重悬细胞后按5×105/ml的密度接种于含无血清培养基的25ml培养瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培养,2-3天半量换液一次,5-7天传代,得到NSCs。将部分传代NSCs按5×105/ml的密度接种于含新生小牛血清培养基,置于37℃、5%CO2孵箱中培养。采用免疫组织化学技术鉴定NSCs及其增殖分化功能。2.建立缺氧NSCs模型:将传代培养的NSCs按5×105活细胞/ml的密度移入无糖DMEM培养基中,放入通入5%CO2和95%N2混合气体的缺氧盒,37℃、5%CO2孵箱中培养。以通气体时间30分钟、1小时及2小时为检测时相点,取出细胞在显微镜下观察细胞形态、台盼蓝细胞计数和CCK-8法检测NSCs活性,然后更换无血清培养基。以上三点与正常对照组存在差异,则表明缺氧NSCs模型制作成功。3.氯化锂干预调控缺氧NSCs增殖机制:根据实验要求,将传代培养的NSCs分为正常对照组,单纯缺氧组,生理盐水干预组,1m M、3m M、5m M氯化锂干预组等6组;按5×105活细胞/ml密度接种至6个35mm培养皿中,其中,正常对照组加入无血清培养基;其余组加入无糖DMEM培养基后入自制缺氧盒,37℃、5%CO2培养箱中培养。缺氧1小时,取出缺氧后的NSCs显微镜下观察细胞形态、记数,并迅速更换无血清培养基继续培养,单纯缺氧组仅缺氧,生理盐水干预组缺氧后加生理盐水,3组氯化锂干预组分别加入氯化锂至所需的浓度,放入37℃、5%CO2培养箱中培养3天后检测Akt/P-Akt、GSK-3b/P-GSK-3b、Caspase-9/P-Caspase-9。结果1.NSCs分离、培养及鉴定:新生SD乳鼠海马分离的细胞在无血清培养基中培养1-2天,呈悬浮生长,细胞呈单个、成对或三个不等、折光性强、边界清楚、呈亮圆形。培养3天后细胞增殖成发亮的圆球状细胞团,大小不等。培养5-7天时神经球逐渐增大,数量逐渐增多,形态规则,中央部发黄,折光性明显降低,周围无突起生长。传代培养细胞形态同原代,经Nestin鉴定该细胞为NSCs,Brd U证实NSCs处于增殖状态;诱导NSCs分化后细胞边缘产生大量突起,互相交织成网,呈三角形、梭形等多种形状,经NSE及GFAP鉴定分化的细胞为神经元、星形胶质细胞。2.NSCs缺氧模型制作:在无糖DMEM培养基和缺氧盒中缺氧培养1小时后,NSCs形态不规则、数量减少、折光性减弱、胞体肿胀、甚至出现细胞膜破裂;缺氧组NSCs死亡数明显增多、活性明显降低(P均<0.05),证明缺氧NSCs模型成功。3.氯化锂调控缺氧NSCs增殖的机制:3m M氯化锂干预组与单纯缺氧组、生理盐水干预组、1m M氯化锂干预组相比红色荧光最强,表明3m M氯化锂干预组缺氧NSCs主要表达P-Akt、P-GSK-3β、P-Caspase-9标记物;5m M氯化锂干预组红色荧光较3m M氯化锂干预组减弱,绿色荧光增强,表明该组细胞主要表达Akt、GSK-3β、Caspase-9标记物。1m M、3m M氯化锂干预组P-Akt/P-GSK-3b/P-Caspase-9阳性细胞数较单纯缺氧组、生理盐水干预组明显增多(P<0.05);与3m M氯化锂干预组相比,5m M氯化锂干预组阳性细胞数明显减少(P<0.05)。结论1.自制缺氧盒可以成功建立NSCs缺氧模型。2.1m M、3m M氯化锂均能促进缺氧NSCs增殖,但3m M氯化锂促进缺氧NSCs增殖的能力较1m M氯化锂强;5m M氯化锂抑制缺氧NSCs增殖。3.1m M、3m M氯化锂干预促进缺氧NSCs增殖时,Akt、Caspase-9及GSK-3?表达逐渐减弱,P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表达逐渐增强。4.5m M氯化锂干预抑制缺氧NSCs增殖时,Akt、Caspase-9及GSK-3?表达逐渐增强,P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表达逐渐减弱。5.氯化锂增加GSK-3?、Caspase-9酶活性与其剂量存在相关性。6.氯化锂通过PI3K/Akt信号通路调控缺氧NSCs增殖。