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能源是人类赖以生存和发展的物质基础之一,随着人类社会历史的前进,石化能源终将枯竭。因此,探寻可再生能源替代石化能源成为当前研究的热点和重点课题。燃料酒精因其适用范围广泛,生产技术成熟和对环境污染低的优势成为世界各国首选的生物质能源。目前,生产燃料乙醇的主要原料为淀粉类和糖质类。纤维素是世界上最丰富的可再生而未被充分利用的生物质资源。纤维素可被纤维素酶降解为葡萄糖,而葡萄糖很容易被微生物发酵生成乙醇。因此,产量大、来源广、可再生的纤维素成为世界各国生物质能源科技优先发展的重点。纤维素的生物降解是由一组纤维素酶协同作用进行的。这组酶是由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。其中,β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组成部分,它不仅参与纤维素降解,而且通过将纤维二糖水解成葡萄糖解除纤维二糖对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶反馈抑制作用。然而β-葡萄糖苷酶在纤维素酶中活力较低,含量较少,而且受产物葡萄糖抑制,成为纤维素降解生产葡萄糖的瓶颈。因此,寻找高活力的耐葡萄糖、耐酒精和耐热的β-葡萄糖苷酶具有重要而深远意义。自然界中蕴藏着巨大的微生物资源。但是,由于纯培养技术局限,仍然有99%的微生物未能实现人工纯培养。这严重阻碍了人类对微生物资源的利用和开发。利用宏基因组技术可以解决未培养微生物不易分离纯化的难题,为人类开启了未培养微生物这一巨大资源的信息大门。本论文旨在利用宏基因组技术,从未培养微生物中获取和糖类水解相关酶的有特异性的基因。本工作直接提取了高糖土壤微生物的宏基因组DNA并进行了纯化,构建了高糖土壤的包含1256个阳性克隆的高糖土壤16S rDNA文库。通过遗传进化分析,表明了高糖土壤环境微生物种群基因的多样性。我们用提取的高糖土壤宏基因组DNA构建了 Fosmid质粒文库,文库约9万个克隆,平均扦入片段大小为34.5 kb,总库容量为3.1×109 bp。文库的外源插入片段有很好的随机性。利用活性筛选策略,我们从文库中筛选到一批普鲁兰酶、β-葡萄糖苷酶和蔗糖酶活性的克隆。从中选取4个粗酶活力高的活性克隆进行深入研究。在这4个克隆中,其中2个β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族3,一个β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族1,另一个蔗糖水解酶Uminv4属于糖基水解酶家族32。上述四个基因经PCR扩增后和pSE380连接并转化到大肠杆菌BL21中,实现过量表达,经纯化后进行深入的酶学特性研究。纯化后的β-葡萄糖苷酶Unbgl3A在pH5.0-7.0和温度低于45℃时比较稳定,其最适反应条件为:pH5.6,温度50℃,果糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和蔗糖对重组酶Unbgl3A有激活作用,其中蔗糖激活作用最大。葡萄糖、木糖、麦芽糖和乙醇对Unbgl3A酶活力有抑制作用。该酶除了能很好地水解p-NPG和纤维二糖外,还能较好的利用p-NP-β-D-cellobioside。Unbgl3A对底物p-NPG的Km值为6.45 mM,最大反应速度Vmax为50 μmol min’1 mg’1。Unbg13B是一个耐受酒精的β-葡萄糖苷酶,具有全新的核苷酸序列。其最适反应条件为:pH7.0,温度40℃。该酶耐受酒精而且酒精对它有较强的激活作用。多种单糖和双糖对它有抑制作用,其中葡萄糖对它有较强的抑制作用。螯合剂EDTA和表面活性剂SDS对该酶有较强的抑制作用。Unbg13B对底物p-NPG的Km值为2.936 mM,最大反应速度Vmax为81.8μmol min-1 mg-1。Unbgl1 A是一个耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。其最适反应条件为:pH6.0,温度50℃。该酶具有较强的耐受葡萄糖特性,而且低浓度葡萄糖对它有一定的激活作用。多种单糖、双糖和NaCL对它有激活作用。金属离子Li+对Unbgl1A有较强的激活作用,使酶活力提高一倍。SDS和高浓度的酒精对Unbgl1 A有较强的抑制作用。而其他金属离子和螯合剂EDTA对Unbgl1 A没有影响。Unbg11A对底物p-NPG的Km值为2.09 mM,最大反应速度Vmax为 183.9 μmol min-1 mg-1。Uminv4是一个蔗糖转化酶,其最适反应条件是:pH6.0,温度60℃。该酶能水解蔗糖、棉子糖和菊糖,以外切作用的方式水解菊糖。本研究通过高糖土壤宏基因组文库的构建,获得了 4个与糖类水解相关酶的基因,并深入研究了它们的酶学特性。结果显示这些酶在核苷酸序列和酶学特性上都有一定特性。证实了宏基因组文库的构建对发现新型酶的优越性。我们所构建的宏基因组文库也可以用于筛选其他工业上有应用前景的新型酶基因。