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研究背景与目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位居我国各种肿瘤死亡率的第二位。在每年新发HCC中,我国占有53.5%的比例,且致死率高达0.93。可见,我国是HCC大国以及重灾国。HCC起病隐匿,早期难以察觉,约80%的患者在确诊时已失去根治性切除的机会,即使手术切除后肝细胞癌仍易出现复发或者转移。因此,无法根治性切除的局部晚期或转移性HCC的治疗一直是临床工作中急需攻克和解决的难题。新型细胞毒药物如奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)和吉西他滨(Gemcitabine,GEM)在晚期HCC的治疗中显示出一定前景,但原发或获得性耐药仍是化疗失败的主要原因。为了揭示新型细胞毒药物在HCC中的耐药机制以及寻求克服耐药的方法,我们研究团队在前期构建了GEM耐药肝癌细胞模型(HepG2GEM/10.0和SMMC-7721 GEM/10.0,以下简称为“HepG2 GR”和“SMMC-7721GR”,统称为“HCC GR”),发现HCC GR细胞发生了上皮间质样转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),进一步的研究表明微小RNAs(MicroRNAs,miRNAs)参与了HCC GR细胞EMT的发生。既往我们应用miRNA芯片技术在HepG2亲本及HepG2 GR细胞中筛选出差异表达的miRNAs,通过生物信息学分析,发现与EMT分子表型有关的转录因子可能是miR-130a-3p的靶基因。鉴于既往研究结果,我们提出“miR-130a-3p调控与EMT相关转录因子的表达参与GEM耐药肝癌细胞发生EMT”的学术假说。本研究拟通过qRT-PCR、Western Blot、报告基因、siRNA干扰和细胞生物学分析等方法,考察miR-130a-3p对靶基因和GEM耐药细胞EMT表型的影响,分析靶基因与GEM耐药细胞EMT表型之间的关系。本研究部分揭示了肝细胞癌产生耐药的机制,为克服肝癌治疗提供了研究策略,具有重要临床意义。方法:1.生物信息学分析,在既往miRNA芯片技术筛选出的差异miRNAs中确定可能参与GEM耐药肝癌细胞发生EMT的关键性miRNA通过miRNA预测软件(DIANAmT;miRanda;miRWalk;PICTAR4;Targetscan),确定可能参与GEM耐药肝癌细胞发生EMT的miR-130a-3p,并预测出其下游可能靶基因Smad4。2.在肝癌亲本和耐药细胞上,考察miR-130a-3p和靶基因Smad4的表达及其相关性在肝癌亲本和耐药细胞之间,以qRT-PCR测定miR-130a-3p的表达,揭示miR-130a-3p在GEM耐药细胞中是否被广泛下调;分别以qRT-PCR和Western-Blot方法,测定靶基因Smad4的表达。分析mi R-130a-3p和靶基因表达的相关性。3.在肝癌亲本和耐药细胞上,考察miR-130a-3p对靶基因Smad4表达和EMT生物学特征的影响1)在肝癌亲本细胞上,转染miR-130a-3p阻遏物和阴性对照,在验证瞬时沉默效应后,以qRT-PCR和Western-Blot方法测定靶基因Smad4的表达。2)在肝癌耐药细胞上,转染miR-130a-3p模拟物和阴性对照,在验证瞬时过表达效应后,以qRT-PCR和Western-Blot方法测定靶基因Smad4的表达。3)构建靶基因Smad4转录本人类全长3’UTR(野生型)荧光素酶报告系统,考察miR-130a-3p是否直接识别靶基因Smad4转录本3’UTR来调节其表达。4)在肝癌耐药细胞上,转染miR-130a-3p模拟物和阴性对照,通过形态学观察、迁徙/侵袭分析、划痕实验、细胞粘附和分离实验等,考察miR-130a-3p过表达对耐药细胞EMT生物学特征的影响。5)MTT法检测肝癌耐药细胞转染miR-130a-3p模拟物和阴性对照后对GEM药物敏感性的影响。4.靶基因Smad4表达对肝癌耐药细胞EMT分子表型和生物学特征的影响1)在肝癌耐药细胞上,转染靶基因Smad4 siRNA瞬时沉默Smad4表达,以qRT-PCR和Western-Blot测定受靶基因转录调节的EMT相关目标基因的表达(E-caherin、Vimentin和MMP-2)。2)在肝癌耐药细胞上,转染靶基因Smad4 siRNA以瞬时沉默Smad4表达,通过形态学观察、迁徙/侵袭分析、划痕实验、细胞粘附和分离实验等,考察靶基因Smad4瞬时沉默对耐药细胞EMT生物学特征的影响。结果:1.miR-130a-3p在HCC GR细胞中广泛下调,Smad4在HCC GR细胞均上调,且miR-130a-3p反向调节Smad4的表达相对于HCC亲本细胞,miR-130a-3p在HCC GR细胞中广泛下调,而Smad4在HCC GR中均高表达。HCC亲本细胞转染miR-130a-3p阻遏物后,Smad4表达上调;HCC GR细胞转染miR-130a-3p模拟物后,Smad4表达下调。2.miR-130a-3p靶向调控Smad4的表达影响GEM耐药肝癌细胞EMT生物学特征荧光素酶报告实验证明miR-130a-3p可直接识别Smad4转录本3’UTR区域。HCC GR细胞转染miR-130a-3p模拟物后,细胞运动能力及粘附分离能力减弱,迁移侵袭能力下降,且增强了耐药细胞对GEM药物的敏感性。3.下调Smad4表达能够逆转GEM耐药肝癌细胞EMT分子表型HCC GR细胞转染靶基因Smad4 siRNA后,Smad4表达显著下调,同时伴有EMT分子表型的逆转:上皮标志物E-caherin表达上调,间质标志物Vimentin和MMP-2表达下调。4.下调Smad4表达影响GEM耐药肝癌细胞EMT生物学特征HCC GR细胞转染靶基因Smad4 siRNA后,耐药细胞粘附分离能力减弱,细胞迁移侵袭能力下降。结论:1.miR-130a-3p靶向调控Smad4表达参与GEM耐药肝癌细胞EMT表型和生物学特征。2.Smad4通过调节下游EMT相关转录因子表达影响GEM耐药肝癌细胞EMT分子表型和生物学特征;干预Smad4表达能够逆转GEM耐药肝癌细胞EMT。