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棉花土传黄萎病是棉花连作障碍的主要病害之一,是一种典型的土传病害,其病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb).传统的化学防控通常会带来环境问题而田间防控措施如轮作和采用抗病品种等也存在许多限制性因素,生物防控日渐成为克服土传植物病害的重要途径。已有的研究表明菌根真菌或死谷芽孢杆菌菌株(Bacillus vallismortis,HJ-5)单独施用对防控棉花土传黄萎病有效果,但二者共同接种对防控棉花土传黄萎病的防控效果和协同作用机制尚未见报道。本文首先通过盆栽试验筛选了适于双接种试验的菌根菌菌株和菌株HJ-5的菌剂接种量。通过三次独立的温室盆栽试验研究了结合施用地表球囊霉(Glomus versiforme, Gv)和死谷芽孢杆菌强化的生物有机肥对棉花土传黄萎病的防病效果。采用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)标记技术构建了菌株HJ-5的GFP标记菌株(GHJ-5),研究了菌株GHJ-5在植株根表和根际的定殖行为。在温室条件下利用分根试验研究了菌株HJ-5和Gv单独接种和混合接种对棉花根系分泌物及抑病效果的影响。另外,还通过一系列的实验室和温室试验了研究病原菌和拮抗菌之间的互作关系。主要结果如下。1.筛选菌根菌和菌株HJ-5接种量的试验结果表明,双接种处理的最适菌根菌菌剂为菌株Gv,菌株HJ-5的最适用量为107CFU·g-1.菌株Gv和HJ-5双接种处理的土传黄萎病发病率最低,发病指数下降了26.71%,植株生物量显著增加。2.三次独立的盆栽试验一致表明,育苗时先接种菌根真菌菌株Gv,移栽时再在连作土壤中施用死谷芽孢杆菌发酵的生物有机肥,防控棉花土传黄萎病的效果最好,发病指数平均降低65%,植株地上部高度,叶面积,地上,下部干重量三次平均分别增加75%,44%,216%,和71%。植株地上部和地下部N和P含量显著增加。对照相比,植株地上部和地下部N含量分别增加83%和65%；地上部和地下部P含量分别增加49%和45%。根际土壤Verticillium dahliae数量显著降低,下降幅度达83%。值得注意的是,菌株Gv在植物根的定殖没有受施用HJ-5生物有机肥的影响。3.实验室分析表明,菌株HJ-5能产生脂肽类物质、吲哚乙酸(IAA)、铁载体、氰化氢(HCN)、氨气,但不产脱氨酶(ACC),不具有解磷能力。GFP标记菌株GHJ-5能够定殖在土传黄萎病病原菌的菌丝上并使其变形和裂解,表明菌株HJ-5为土传黄萎病的拮抗菌。4.双接种菌株Gv和GHJ-5的盆栽试验结果表明,与单接种菌株GHJ-5或Gv相比,棉花植株的生物量、根系密度、植株磷含量、棉花植株根内和根际的菌株GHJ-5的数量都有显著增加,说明菌株Gv与GHJ-5双接种能够促进棉花的生长。5.分根试验表明,双接种菌株Gv和HJ-5处理棉花土传黄萎病发病指数比对照下降了63.3%。棉花根系分泌物中发现4种酚酸,所有酚酸在低浓度时促进大丽轮枝菌的生长和孢子的萌发,浓度升高到一定程度,抑制病原菌孢子的生长。接种菌株Gv和HJ-5显著地减低了根系分泌物中酚酸类物质的浓度。接种V. dahliae、菌株Gv或HJ-5均系统性地改变了根系分泌物的组成。6.对盆栽试验植株样品的分析表明,双接种菌株Gv和HJ-5显著提高了植株防卫酶如内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶等酶的活性,增加了叶片水杨酸和叶绿素含量、降低了植株茎基部胼胝质含量,减轻棉花土传黄萎病发病症状。综上所述,本文证实了菌株Gv和HJ-5双接种处理具有协同促进植物生长和抑制植物病原菌生长的作用。菌株Gv能够帮助植物吸收土壤中的养分元素,菌株HJ-5具有产生拮抗物质的能力,二者在土壤和植株上的成功定殖是防控棉花土传黄萎病的关键。接种菌株HJ-5和Gv对棉花根系分泌物的改变作用与植物系统抗性有关,这与接种菌株HJ-5和Gv之后植物防御性酶活性等特征的变化是一致的。本文的研究结果有助于研发新型棉花土传黄萎病防控技术。今后应进一步研究生物有机肥中功能菌在修复土壤障碍因子中的分子生物学机制。