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第一部分融合蛋白sCAR-PPA介导Ad-EGFP检测甘露糖型白血病细胞
白血病(Leukemia)是一种造血系统的原发恶性肿瘤，很容易发生全身多脏器的转移和浸润，这过程很可能与细胞膜表面糖蛋白及糖链结构变化有关。掌叶半夏凝集素(PinelliaPedatisecta AgglutininPPA)是存在于中草药掌叶半夏中的单子叶甘露糖型植物凝集素，能特异性识别并结合甘露糖。其特有的糖结合特性可能为分析各种肿瘤细胞表面糖链结构变化及对肿瘤恶化、迁移及预后等方面的研究提供有用的工具。本课题基于PPA的特性主要研究：sCAR-PPA融合蛋白结合腺病毒Ad-EGFP检测甘露糖型白血病细胞。
为了应用PPA标记甘露糖型白血病细胞，本课题构建了sCAR-PPA融合蛋白，该融合蛋白的sCAR部分可与5型腺病毒结合，PPA部分与白血病细胞表面的甘露糖结合，从而介导5型腺病毒Ad-EGFP标记细胞表面暴露甘露糖基的白血病细胞。细胞实验中，将原核表达的sCAR-PPA融合蛋白与腺病毒Ad-EGFP共同处理Kasumi-1、K562、KG-1细胞，以PBS与Ad-EGFP处理细胞作为对照。结果显示，融合蛋白sCAR-PPA可显著提高Ad-EGFP对Kasumi-1，K562细胞的感染效率(P＜0.05)，提示PPA可以特异性地检测阳性表达甘露糖残基的白血病细胞。同时发现，sCAR-PPA未提高Ad-EGFP对于KG-1细胞的感染。上述两种不同结果表明甘露糖型白血病细胞具有细胞类型特异性。进一步研究PPA标记阳性的白血病细胞在白血病发生发展中的功能或地位是我们今后的研究方向。
第二部分细胞内表达PPA对癌细胞的杀伤作用研究
关于PPA抗肿瘤的研究，目前都是作为外用药物，对PPA的药理作用机制未进行深入研究。因此我们为了进一步研究了PPA基因细胞内表达对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制。利用pcDNA3.1/His-PPA转染肿瘤细胞Western blot检测显示PPA在细胞内表达。以pcDNA3.1(+)-PPA及带有人源t-PA分泌信号肽的pcDNA3.1(+)-tPA-PPA载体转染肿瘤细胞，PI染色结果显示，PPA真核表达质粒转染比空载体转染明显提高PI阳性细胞的比例。同时MTT实验也证明二者都能够抑制肿瘤细胞的生长，而且pcDNA3.1(+)-PPA组比pcDNA3.1(+)-tPA-PPA组抑制作用稍好。因此，结果显示PPA基因细胞内表达可以杀伤肿瘤细胞。
以pEGFP-PPA-C1转染细胞，显示EGFP-PPA蛋白起初以散点的形式分布在细胞，而后聚集于细胞某一区域，并且与DNA荧光染料PI染色区重叠。而且激光共聚焦结果显示融合蛋白在细胞核区也有分布。结果提示蛋白可进入细胞核并进一步与DNA结合引发染色质聚集，可能通过形成异染色质的方式而起到杀伤细胞的作用。实验结果为今后以PPA应用于肿瘤基因治疗提供了一定的依据。