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目的:探讨肺经引经药桔梗对顺铂抗肺癌作用的协同增效作用,并从药效学、药物动力学和分子生物学等方法初步探讨其作用机制。方法:1.桔梗对顺铂抗裸鼠A549原位移植瘤的影响通过质粒转染,构建带有荧光素酶的人非小细胞肺癌A549-luc细胞。将A549-luc细胞通过胸腔穿刺方法接种至裸鼠右肺,建立裸鼠原位肺腺癌移植瘤动物模型,将造模组随机分为为:模型组;顺铂(DDP)组;DDP+桔梗(PG)低剂量组;DDP+PG中剂量组;DDP+PG高剂量组。给药周期30天,观察裸鼠的各项生命体征,小动物活体成像技术观察记录各组裸鼠的瘤体生长变化及转移情况,最后一次给药24h后取材,称量裸鼠体重及脏器重量,并计算脏器指数。采用HE染色法观察药物治疗后裸鼠肺脏、肾脏及肝脏的病理学变化特点;提取肿瘤组织蛋白后,采Western bolt法观察裸鼠移植瘤组织Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9的蛋白表达的变化情况。2.桔梗对顺铂在裸鼠体内趋向性分布影响利用高效液相色谱法检测桔梗对顺铂在裸鼠体内的趋向性分布情况,评价桔梗对顺铂是否具有引经作用,并利用RT-qPCR方法检测裸鼠肺组织中AQP1、AQP5、P-gp的mRNA表达情况,初步探讨桔梗联用顺铂的引经作用及可能机制。3.桔梗对顺铂抗A549细胞增殖的影响采用MTT法来检测不同浓度桔梗组(PG:1、2.5、5、6、8、10 mg/mL)、顺铂组(DDP:0.5、1、2、5,10 mg/L)及两药不同给药顺序联合组作用于A549细胞后,对肿瘤细胞增殖抑制作用,并计算出联合用药指数。流式细胞术(FlowCytomery,FCM)检测PG(4 mg/mL)组、DDP(5 mg/L)及PG+DDP联合组处理A549细胞24h后对细胞的周期阻滞、凋亡率的影响。Western bolt法检测A549细胞经PG,DDP作用单独或联合给药及经抑制剂LY29400作用后Akt、P-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9的蛋白表达的变化情况。结果:1.桔梗对顺铂抗裸鼠A549原位移植瘤的影响(1).动物一般生命体征:接种后,活体成像观察,移植瘤成瘤率100%。裸鼠接种后至给药前:各组小鼠的饮食、活动、生长和精神状态都正常;化疗初期(给药第5天至15天)模型组裸鼠体重增加,各给药组裸鼠体重开始下降,各给药组裸鼠的皮肤颜色变浅;化疗中期(给药第16天至25天):与模型组相比,给药各组裸鼠活动减少,皮下脂肪减少,皮肤失去光泽变粗糙;化疗后期(给药第26天至35天):模型组裸鼠进食下降,活动量减少,呼吸频率加快,体重开始减轻,连续出现死亡。顺铂组老鼠精神萎靡不振,与顺铂单用组相比,联用桔梗各组老鼠活动量多,行动较为灵活。实验周期35天内,模型组DDP组;DDP+ PG低剂量组;DDP+PG中剂量组;DDP+PG高剂量组的死亡率分别为:50%、8.3%、8.3%;0%、8.3%。(2).桔梗对顺铂抑瘤率的影响:与模型组相比较,各给药组瘤指数均有显著下降,DDP及DDP联用桔梗低、中、高剂量的抑瘤率分别为25.44%、42.28%、55.0909%、35.82%(P<0.05)。与DDP单用组相比较,联合桔梗低、中、高剂量组抑瘤率分别增强了19.18%、39.76%、13.92%,中剂量桔梗组差异最显著(P<0.05)。与模型组相比较,各给药组明显降低了裸鼠的肝脏指数、脾指数(P<0.05)。(3).桔梗联用顺铂对肿瘤凋亡相关蛋白表达的影响:与模型组相比,DDP组及DDP联用桔梗各组均显著上调了裸鼠移植瘤中Bax蛋白的表达(P<0.05),但DDP单用组还显著上调了Akt、Bcl-2的表达(P<0.05);与DDP组相比,各联合用药组的Bax蛋白表达有上升趋势,DDP+PG高剂量组显著上调(P<0.05)。另外与DDP组的C-caspase-9相比,DDP联用PG低、中、高剂量组均上调其表达,分别上调了 18%、94%、115%。2.桔梗对顺铂在裸鼠体内趋向性分布影响(1).桔梗对顺铂组织分布影响:桔梗显著增加了顺铂在肺脏、脾脏的药物浓度,低、中、高剂量增加幅度分别为31.1%、43.0%、33.0%;51.0%、30.0%、18.9%。与此同时,联用桔梗显著降低了顺铂在肝脏、心脏、小肠中的药物浓度,低中高剂量降低幅度分别为 15.7%、38.3%、56.1%;45.7%、52.3%、37.8%;43.0%、45.6%、62.3%。与其他脏器相比较而言,血浆和肾脏联用桔梗前后,变化较小。(2).RT-qPCR结果显示,与对照组相比较,各给药组显著降低肿瘤组织中AQP1的mRNA表达(P<0.05)。与对照组相比较,顺铂对P-gp的mRNA表达无显著影响,然而,联用桔梗后显著降低P-gp的基因表达(P<0.0l);与DDP组比较,联用桔梗低、中、高剂量对P-gp基因表达分别降低32.62%、28.88%、65.78%。3.桔梗对顺铂抗A549细胞增殖作用的影响(1).桔梗、顺铂对A549细胞增殖的影响:桔梗对A549细胞增殖具有抑制作用,桔梗作用 24h、48h、78h 的 IC50值分别为:6.22±0.56、5.34±0.23、4.61±0.97 mg/mL。DDP可浓度-时间依赖性的抑制A549细胞增殖,给药24h、48h、78h的IC50值分别为:7.22±0.89、2.48±1.01、0.78±0.78mg/L;桔梗联用顺铂抗A549增殖效果与二者给药顺序有关:同时给予PG(4mg/mL)和DDP(5mg/L)培养A549细胞48h后,抑制率最高。二者联合用药指数Q值在0.85-1.15之间,提示二者联用药效叠加。(2).流式细胞术检测桔梗联用顺铂对A549细胞周期阻滞:与control组比较,PG(4mg/mL)组,G0/G1期比列明显上升,S期比例下降,表现为G0/G1期阻滞(P<0.01);与control组比较,顺铂(5mg/L)组,S期比例上升,表现为S期的细胞运动阻滞(P<0.01);而PG和DDP联合作用于人肺癌A549细胞后,与DDP单用组比较,G0/G1期比例增高了 48.01%(P<0.01),及S期细胞比例下降19.83%(P<0.01)。(3).流式细胞术检测桔梗联用顺铂对A549细胞凋亡的影响:PG(4mg/mL)、DDP(5 mg/L)组及二者联合用药组A549细胞的凋亡率分别为18.83%,27.77%,53.00%,均高于control组的4.40%(P<0.01)。联合用药组的凋亡率(53.00±5.20)分别高于PG组(18.83±6.12)及DDP(27.77±1.77),差异具有统计学意义(P<0.01),与顺铂单用组相比较,联用桔梗显著性的增加了 A549细胞的晚期凋亡率(P<0.01)。(4).Western blotting分析结果显示:在分别单独用DDP、PG及其联合使用作用于A549的基础上加用P13K特异性抑制剂LY294002,观察PG+DDP与LY294002+DDP的作用情况。与空白对照组相比:PG组及DDP组组显著下调Bcl-2蛋白表达(P<0.05),DDP+PG显著下调Bcl-2与P-Akt的表达(P<0.05)。与DDP单独用药组比较,DDP联用PG和LY294002后P-Akt蛋白及Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05)。LY294002+DDP组与PG+DDP组相比较,各组蛋白表达无显著差异。结论:桔梗可增强顺铂抗裸鼠A549原位移植瘤生长,改善裸鼠生存质量,延长裸鼠生存率,其相关作用机制可能与其影响顺铂在裸鼠体内分布、改变肿瘤细胞周期分布和相关凋亡蛋白有关。