【摘 要】
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昆虫能够产生抗冻蛋白来抵御低温引起的伤害，它不仅可以有效地抑制冰晶的生长，改变冰晶的形态以及抑制重结晶，还可以与细胞膜相互作用，起到保护细胞膜的完整性以及稳定膜结构的功
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昆虫能够产生抗冻蛋白来抵御低温引起的伤害，它不仅可以有效地抑制冰晶的生长，改变冰晶的形态以及抑制重结晶，还可以与细胞膜相互作用，起到保护细胞膜的完整性以及稳定膜结构的功能。抗冻蛋白可能不是独立在细胞中发挥作用的，而是通过与其他蛋白质相互作用以后相互协调共同发挥功能，但是目前关于这方面的研究非常少。因此为了对抗冻蛋白的特性和功能有更深入的了解，筛选与抗冻蛋白相互作用的蛋白质是十分有必要的。准噶尔小胸鳖甲（以下简称小胸鳖甲）是新疆准噶尔盆地特有的拟步甲科昆虫，其所处生境位于我国的西北角，为典型的荒漠环境，昼夜温差很大，气候异常干燥炎热。如此极端恶劣的地理环境下所产生的抗冻蛋白具有更高的热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）、热稳定性以及其他的生物学特性，但目前关于小胸鳖甲抗冻蛋白的研究大多集中于蛋白质结构或者蛋白质本身的功能方面，对其相关作用网络方面的研究很少。因此本实验利用小胸鳖甲作为研究材料，采用酵母双杂交技术筛选与小胸鳖甲抗冻蛋白（MpAFP149）相互作用的蛋白质，最终筛选出了动力蛋白轻链2(DLC2)以及一种功能未知蛋白。并利用GST-Pulldown实验验证了DLC2与MpAFP149之间的相互作用关系。具体结果如下：1.酵母双杂交筛选与MpAFP149相互作用的蛋白质将Mpafp149基因构建至pGBKT7载体上，形成融合表达的BD-MpAFP149作为诱饵蛋白进行自激活检测，结果显示MpAFP149并没有自激活特性可以作为诱饵蛋白。诱饵蛋白的表达检测表明BD-MpAFP149在酵母体内得到了正确的表达。同时构建小胸鳖甲的cDNA文库，利用诱饵蛋白对文库进行了筛选，实验分别经过添加有x-α-Gal和AbA的SD/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu缺陷型培养基进行筛选后最终获得3个阳性克隆，阳性克隆经过反复涂布SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基以及酵母质粒回转实验更大程度地保证了双杂交实验的准确性。通过对3个阳性克隆的插入片段进行测序以及序列分析后发现与MpAFP149相互作用的蛋白质分别属于细胞骨架蛋白的动力蛋白轻链2以及一种功能未知的蛋白。2. GST pull down实验验证小胸鳖甲抗冻蛋白（MpAFP149）与动力蛋白轻链2（MpDLC2）的体外相互作用将酵母双杂交筛选出来的Mpdlc2基因构建至pGEX4T-1载体上进行融合表达作为诱饵蛋白，将Mpafp149基因构建至pET28a载体上融合表达作为捕获蛋白，最后将结合物洗脱液进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果显示用GST单克隆抗体检测时，在GST+His-MpAFP149与GST-MpDLC2+His-MpAFP149的泳道中分别出现了26kD （GST）和35kD（GST-MpDLC2）的杂交信号；用His-MpAFP698抗血清进行检测时，在GST+His-MpAFP149的泳道中没有出现杂交带，而在GST-MpDLC2+His-MpAFP149的泳道中则有一个16kD左右（His-MpAFP149）的条带。实验结果表明MpDLC2与MpAFP149两种蛋白之间确实存在相互作用的关系。
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