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糖尿病是一种临床常见的代谢疾病，近年糖尿病的发病率呈高速增长的态势。其发病率高，并发症危害严重。目前，糖尿病临床诊断常用的方法主要有：血糖测定，糖耐量试验以及糖化血红蛋白（HbA1c）测定。这些方法虽然能有效的诊断糖尿病，但是无法做到早期诊断。很显然糖尿病的早期发现，对糖尿病的防控和治疗意义重大。血液中葡萄糖与蛋白质之间的交联反应主要是非酶促反应。人血清白蛋白（Human serum albumin HSA）是血液中的高丰度蛋白，其发生非酶糖基化反应的几率也最大。HSA较长的半衰期保证了在一段时间内葡萄糖的波动以蛋白糖基化的形式保留下来，从而为糖尿病的早期发现留下依据。糖尿病患者早期表现为血糖调节能力减弱，血糖升高或波动，与蛋白的非酶糖基化反应加快。针对糖尿病的早期诊断，本文提出了一种新的研究策略：以HSA为研究对象，从不同的角度研究HSA各肽段对葡萄糖修饰的反应程度，最终筛选出一组能反映HSA蛋白糖基化水平的特征性肽段作为糖尿病潜在的生物标志物，并用大量临床样本进行了验证。本论文的主要研究内容和结果如下：1. HSA非酶糖基化修饰及其产物的研究。不同浓度的葡萄糖与HSA在体外共育，建立体外非酶糖基化模型。采用电泳及高分辨MALDI–TOF考察糖基化前后HSA分子量的变化，对非酶糖基化模型进行评价。糖基化HSA经变性、还原、特异性的Glu-C酶解，采用HPLC-TOF对酶解肽段进行色谱分离及质谱检测。由于反应试剂为13C葡萄糖与12C葡萄糖（1:1）混合的同位素标记试剂，这样发生糖基化修饰的肽段就会以成对标记峰的形式出现在质谱中。采用Peakpair软件对标记肽段进行筛选、分析，发现非酶糖基化反应具有时间依赖性和浓度依赖性。随着糖浓度（25mM，50mM，500mM）的增加，筛选到的糖基化肽段数量从6条增加到30条。随着孵育时间（10d，20d，30d）的延长，糖基化肽段数量从6条增加到26条。对糖基化产物初步分析显示，有6条糖基化肽段的修饰产物逐渐从阿玛多利产物向着稳定的晚期糖基化终产物演变，表明这6条肽段对葡萄糖修饰敏感且具有累积效应。通过对糖基化合成标准肽段的研究，建立了中性丢失扫描结合高能二级质谱碎裂的非酶糖基化肽段序列鉴定方法，并成功鉴定了HSA中主要糖基化肽段的序列。2. HSA糖敏感肽段的筛选及糖基化程度评价方法研究。通常情况下蛋白质糖基化水平主要是通过对糖蛋白或糖肽定量来表征。本文对HSA糖基化的研究采用了一个新的策略：不直接测定某一肽段糖基化的生成量，而是检测该肽段未发生修饰的剩余量。即某一肽段糖基化修饰量越多，则该肽段未发生修饰剩余的量越少，以此来反映蛋白质的糖基化程度。采用Q-TOF MSMS筛选质谱中容易离子化，且无漏切位点的HSA肽段作为目标肽段。对不同糖基化反应时间以及不同糖浓度下HSA目标肽段的进行质谱检测，数据经过MPP软件对齐、归一化处理后，利用实验室自行开发的肽段筛选软件对目标肽段进行筛选，最终获得目标肽的提取离子流色谱峰面积。另外，在研究中发现，HSA中存在基本不被糖基化修饰的肽段，它们实际代表了糖蛋白的总量，选取这类肽段作为内标。目标肽段与内标肽段峰面积的比值则代表了该肽段的糖基化水平。此外，为了考察人血液中其他蛋白的干扰，以人血清样品为研究对象，建立体外糖基化血清模型，采用相同的研究方法对血清中的HSA糖敏感肽段进行了筛选。经过两轮实验，最终筛选出1条内标肽段DYLSVVLNQLCVLHE以及12条糖敏感肽段作为糖尿病早期诊断生物标志物的候选物，用于下一步临床样品的验证。3.生物标志物候选肽的临床样品验证。借鉴定向蛋白质组学的研究策略，以HSA的酶解肽段作为标肽，采用Skyline软件结合Q-TOF MS MS实验数据，以及前期已筛选的糖敏感肽段信息，建立了MRM相对定量方法。进一步，采用已建立的MRM相对定量方法，对172例临床样品进行检测，其在包括正常对照、糖尿病以及糖耐量低减三类样品。采用统计学软件SPSS进行了医学统计与单因素ANOVA分析。结果显示，2条糖敏感肽段VAHRFKDLGEE和VSKLVTDLTKVHTE在正常对照组，糖耐量低减组以及糖尿病组三组间均具有显著性差异，可作为潜在的糖尿病早期诊断生物标志物。其余5条肽段在糖耐量低减组与糖尿病组，或糖耐量低减组与正常对照组间无显著差异，但在糖尿病组与正常对照组间有显著差异。因此，后续研究中可将这些肽段作为潜在标志物的候选肽段，进行重复验证和进一步的研究。本文发展了基于非酶糖基化特点的蛋白质糖基化水平评价的新方法，筛选出一组可稳定检出的糖敏感肽段作为糖尿病生物标志物的候选肽段，为糖尿病的早期诊断和治疗提供了具有潜在应用价值的诊断指标。