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目的：受体酪氨酸激酶作为细胞跨膜蛋白，在恶性肿瘤细胞的信号转导中发挥重要的作用，参与调节细胞生长、分化、粘附、增殖和迁移等多个生理过程。因此受体酪氨酸激酶是癌症治疗和药物研发的热门分子靶点。Axl是受体酪氨酸激酶TAM家族成员之一，Axl及其配体Gas6在许多恶性肿瘤中都有高表达。近年来，Axl/Gas6作为癌症治疗的新靶点引起了广泛关注。单克隆抗体药物以其特异性强、安全性高、毒性低、临床疗效好等优点，在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。针对Axl靶点开发特异性候选抗体药物，将为肿瘤临床治疗提供更多选择。 方法：本研究通过杂交瘤技术制备靶向Axl功能性单克隆抗体。借助生物信息学、结构生物学对Axl胞外段进行序列、结构分析，将Axl参与与Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表达载体中，构建重组质粒，并转化至大肠杆菌BL21中，以IPTG诱导、表达并纯化获得目标蛋白。利用目标蛋白免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合、杂交瘤细胞克隆化培养，利用ELISA、流式细胞术、Western印迹等实验进行抗体筛选；钓取目标抗体基因，进行基因序列比对分析；进一步通过竞争ELISA、抑制增殖、划痕实验、迁移实验等实验评价抗体体外生物学活性。 结果： 1、抗原的制备 对人 Axl胞外段进行序列、结构分析，结果提示 Axl胞外区的Ig-like-C2-type-1(27-128aa)为 Gas6识别的功能域。将包含 Axl全长中第27-128aa(F1)的基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建 pGEX-4T-1-F1表达质粒并转化大肠杆菌BL21感受态细胞，优化后获得GST-F1可溶性表达并亲和纯化；经 SDS-PAGE电泳和 Western印迹等实验方法鉴定，表达纯化获得的蛋白为预期的GST-F1融合蛋白，为免疫动物制备单克隆抗体奠定了基础。 2、抗Axl mAb的制备、筛选和鉴定 GST-F1融合蛋白免疫 BALB/c小鼠后进行杂交瘤融合，以 GST-F1融合蛋白进行ELISA筛选，同时以GST蛋白进行负性筛选，挑取特异性识别 GST-F1而不与 GST蛋白结合的抗体克隆。进一步结合流式细胞筛选，最终获得2株稳定分泌抗Axl mAb的杂交瘤细胞株（8-11，16-7）。扩大培养杂交瘤细胞8-11、16-7，制备小鼠腹水，经纯化获得抗体。利用小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒分析，显示2株抗体株抗体的重链亚类为IgG3，轻链为κ型。ELISA结果显示，筛选得到的2株抗Axl mAbs不仅可以特异性识别GST-F1抗原，同时可以特异性识别真核表达的Axl胞外段与人 IgG-Fc融合蛋白（Fc-Axl-ECD）；利用 Axl高表达的细胞株进行Western Blot以及流式细胞分析，结果显示筛选得到的2株抗Axl mAbs可以特异性识别天然表达的Axl蛋白。 钓取了2株抗体的基因并测得基因序列，所得序列在 GenBank中与抗体核酸序列进行比对分析，结果显示2株抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠 IgG可变区序列的同源性均超过96％，确定基因序列为抗体序列；分析抗体轻链和重链可变区基因，确定抗体的FR区和 CDR区。 3、抗Axl单克隆抗体体外生物学活性 竞争ELISA、抑制增殖、划痕实验、迁移实验等实验结果显示，获得的两株抗Axl单克隆抗体具有良好的体外生物学活性。竞争ELISA的结果显示，抗Axl mAb能特异性竞争Gas6结合Axl蛋白。借助Axl高表达的MDA-MB-231细胞进行抗体生物学活性评价，结果显示抗Axl mAb使内源性的Axl含量减少，并同时抑制其磷酸化，抑制增殖实验结果显示，筛选获得的抗 Axl mAb对 MDA-MB-231细胞的增殖无明显影响；Transwell实验和划痕实验结果显示，抗 Axl mAb抗体能显著抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。 结论： 1、通过计算机模拟分析，确定人Axl与Gas6相互作用的关键结构域，并经原核表达、纯化，获得了纯度较高的GST-F1的融合蛋白片段。 2、通过杂交瘤技术获得了2株特异性识别人Axl的单克隆抗体8-11，16-7。 3、抗Axl mAb在一定程度上可以特异性阻断GAS6与Axl结合，下调Axl表达，抑制Axl磷酸化；抗Axl mAb抗体对MDA-MB-231细胞迁移能力有抑制作用，但是对其抑制增殖无明显影响。