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目的采用逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(RT-PCR-RFLP)方法,研究大肠癌中IGF2基因印迹状态的改变,分析印迹基因IGF2的印迹丢失与大肠癌的关系,探讨IGF2的印迹丢失在大肠癌发生发展中的印迹调控机制,并探讨其与大肠癌生物学行为的关系。方法一、实验材料实验标本:收集56例人原发性大肠癌患者原发灶和癌旁组织标本。二、实验方法1.组织DNA/RNA提取和鉴定取约100mg冻存组织标本,常规用10%SDS/氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光度法测定A 260/A 280,DNA样品的比值为1.8-2.0为最佳。TRIZOL试剂/氯仿/异丙醇/乙醇提取RNA。2.筛选杂合子标本IGF2第九外显子内有一ApaⅠ多态酶切位点,只有当标本的基因型为杂合状态时,才能为区分两条等位基因的表达产物提供信息。IGF2引物序列上游P2:5’-CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG-3’,下游P3:5’-GGTCGTGCCAATTACATTTCA-3’。退火温度54℃,产物片段为292bp,由上海生工公司代为合成。在20μl PCR反应体系中,含10×PCR buffer 2μl,50mM MgCl2 1μl,10mM dNTP 0.4μl,10μM引物1.6μl,ddH2O 14μl,TaqE 0.2μl,DNA 20μl。PCR反应条件为:94℃2min→(94℃30 s→54℃30 s→72℃1min)×30个循环→72℃5min。取PCR产物8μl琼脂糖凝胶电泳,ApaⅠ酶切后37℃水浴过夜,聚丙烯酰胺凝胶电泳,genefinder核酸染料染色,对杂合子进行筛选。因36bp片段较小,条带较弱,不易分辨,故以256bp为酶切判断标准,出现292bp和256bp两条条带为IGF2杂合个体(AB型),只出现292bp条带(A型)或出现256bp(B型)为IGF2纯合个体。3.基因印迹状态检测选择杂合子标本,对其RT-PCR产物用相同的内切酶切,酶切后经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果IGF2的基因表达呈双等位基因表达型(AB型)即292bp和256 bp同时存在,说明发生了印迹丢失。如果只出现292bp条带(A型)或出现256bp(B型),说明转录来自于一条等位基因,即维持正常印迹状态。4.统计学处理采用Fisher确切概率法分析IGF2印迹丢失与临床病理资料的相关性。所有数据均用SPSS 16.0软件进行分析。结果1.PCR产物检测产物为292bp,通过对PCR反应液的琼脂糖凝胶电泳后图像分析,以成功合成产物。2.杂合标本的筛选56例待测标本中,共筛出29例IGF2杂合标本,其阳性率为51.79%(29/56)。其中杂合丢失1例。3.印迹状态检测杂合标本的正常组织反转录的cDNA,经PCR后,再经ApaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,在28例无杂合性丢失的杂合子中,有17例(60.71%)肿瘤组织发生了LOI。在这17例肿瘤组织对应的癌旁组织中,有14例(82.35%)发生了LOI,另外3例没有LOI。肿瘤组织和癌旁组织均无印迹丢失的有7例(25%)。4.IGF2的LOI与临床病理特征的关系28例有意义的样本中,淋巴结转移的有13人,发生LOI的有11人;无淋巴结转移的15人,发生LOI的有6人。IGF2的LOI与淋巴结转移存在相关性(P＜0.05),与肿瘤患者的年龄,性别,肿瘤发生的部位均无关(P＞0.05)。结论大肠癌组织和癌旁正常组织均出现LOI,发生LOI的肿瘤组织病例中癌旁组织LOI发生率明显高于未发生LOI的肿瘤组织病例中癌旁组织出现LOI的发生率。两者相比有显著性差异(P＜0.05)。IGF2基因的LOI与临床病理学特征(年龄,性别,发生部位)无统计学相关性,与淋巴结转移存在正相关性。