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目的:香槟方是治疗术后胃肠动力障碍的经验方,方中包含乌药、砂仁、人参、桃仁和槟榔5味药材,生物碱是香槟方的主要物质基础。本文采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)技术,建立香槟方中槟榔次碱、槟榔碱、去甲异波尔定、波尔定碱4种生物碱成分的含量测定方法并比较4种生物碱成分在复方及单味药煎煮液中含量的差异;建立去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠血浆及PBS缓冲液中的定量分析方法,研究香槟方中去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠体内的药代动力学特征及血浆蛋白结合率,以期为香槟方的质量控制、作用机制探讨及临床合理用药提供科学依据。方法:1.香槟方中槟榔次碱、槟榔碱、去甲异波尔定和波尔定碱4种生物碱成分的含量测定方法:采用 Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(2.1×150 mmm,1.7 μm)色谱柱;流动相条件为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～1 min,5%B;1～3.5 min,5%～70%B;3.5～4.5 min,70%～95%B;4.5～6.5 min,95%～5%B;6.5～8 min,5%B);流速0.2 m L·min-1;柱温:30℃;进样量:2 μ L。质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描,多反应监测(MRM)模式检测。各化合物的定量离子对分别为:m/z 142.10→44.11(槟榔次碱),m/z 156.20→44.07(槟榔碱),m/z 314.29→265.12(去甲异波尔定),m/z 328.13→265.10(波尔定碱)。2.去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠血浆及PBS缓冲液中测定方法的建立:以青藤碱为内标,采用蛋白沉淀法对血浆样品及PBS缓冲液样品进行预处理,沉淀剂为5倍体积乙腈。分析方法为:采用 Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(2.1 × 150 mm,1.7 μm)色谱柱;流动相采用0.1%甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脱;流速0.2 m L·min-1;总分析时间为8 min;柱温:30℃;样品管理器温度:10 ℃;进样量:2 μL。质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描,多反应监测(MRM)模式检测。各化合物的定量离子对分别为:314.29→265.12(去甲异波尔定),m/z 328.13→237.07(波尔定碱),m/z 330.32→152.12(青藤碱,内标)。3.香槟方中去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠体内的药代动力学研究:正常大鼠分别单次灌胃给予香槟方水煎液(生药量为1 g·mL-1,去甲异波尔定和波尔定碱的的剂量分别为6.54 mg·kg-1和0.38 mg·kg-1)、乌药单煎液(生药量为0.22 g·mL-1,去甲异波尔定和波尔定碱给药剂量分别为10.03 mg·kg-1和0.53 mg·kg-1)、去甲异波尔定单体(给药剂量为6.54 mg·kg-1)、波尔定碱单体(给药剂量为0.38 mg·kg-1);术后肠麻痹(POI)大鼠单次灌胃给予香槟方水煎液(生药量为1 g·mL-1,去甲异波尔定和波尔定碱的的给药剂量分别为6.54 mg·kg-1和0.38 mg·kg-1)后按各时间点从大鼠眼眶静脉丛取血。采用已建立的UPLC-MS/MS法测定各时间点大鼠血浆中去甲异波尔定和波尔定碱的浓度,以DAS 2.0软件求算药动学参数,并采用SPSS 20.0软件对各组大鼠的主要药动学参数进行统计分析。4.去甲异波尔定及波尔定碱血浆蛋白结合率测定:正常大鼠随机分为正常组及POI模型组,采用平衡透析法结合已建立的UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆及PBS缓冲液中去甲异波尔定及波尔定碱的质量浓度,根据相应公式计算去甲异波尔定及波尔定碱在正常和POI模型大鼠血浆中的蛋白结合率,并采用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果:1.香槟方中槟榔次碱、槟榔碱、去甲异波尔定和波尔定碱4种生物碱成分的含量测定:成功建立同时测定香槟方中槟榔次碱、槟榔碱、去甲异波尔定和波尔定碱的分析方法,各化合物分别在0.48～57.48 ng·mL-1(槟榔次碱),0.98～78.08 ng·mL-1(槟榔碱),0.81～64.96 ng·mL-1(去甲异波尔定),0.09～18.24 ng·mL-1(波尔定碱)浓度范围内线性关系良好(r≥0.9948),平均加样回收率为93.73%～104.34%,RSD(n=6)均小于5%。香槟方中槟榔次碱、槟榔碱、去甲异波尔定、波尔定碱的含量分别为:(90.07±1.26)、(445.27±12.39)、(742.35±38.39)、(38.50±3.33)μ g · g-1,均显著低于单煎液中的含量。2.去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠血浆及PBS缓冲液中测定方法的建立:大鼠血浆中去甲异波尔定和波尔定碱均在0.1～60 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好(r≥0.9965);PBS缓冲液中去甲异波尔定和波尔定碱的线性范围为1～100 ng·ml-1(r≥0.9980);日内、日间精密度良好,RSD均小于11%,准确度在-8.1%～5.0%之间;提取回收率均大于63.7%,基质效应在(89.6±1.9)%～(111.3±3.9)%之间;各条件下血浆及PBS样品稳定性结果相对误差范围为-12.0%～10.8%。3.香槟方中去甲异波尔定和波尔定碱在大鼠体内的药代动力学研究:去甲异波尔定和波尔定碱单体组大鼠体内去甲异波尔定和波尔定碱的各主要药动学参数与香槟方组比较,均具有显著性差异;去甲异波尔定和波尔定碱在乌药组大鼠体内的Cmax和AUC高于香槟方组,但MRT缩短。与正常大鼠相比,去甲异波尔定和波尔定碱在POI模型大鼠体内的Cmax和AUC增大,体内驻留时间(MRT)延长,清除率(CLz/F)减小。4.去甲异波尔定及波尔定碱在正常大鼠体外的血浆蛋白结合率分别为48.58%～63.00%和69.90%～75.11%;在P0I模型大鼠体外的血浆蛋白结合率分别为42.74%～60.76%和65.55%～66.43%,属于中等结合型成分。波尔定碱血浆蛋白结合率的差异具有显著性(P<0.01)。结论:1.本文建立的UPLC-MS/MS法灵敏度高、专属性强、准确可靠,适用于香槟方中4种主要生物碱成分的定量分析及血浆、PBS缓冲液样品中去甲异波尔定和波尔定碱的含量测定。2.单体给药、乌药单味药给药、香槟方复方给药后去甲异波尔定及波尔定碱的药代动力学行为差异显著,香槟方复方给药后去甲异波尔定和波尔定碱的血药浓度变化更平缓,有利于其药效作用的稳定发挥。3.香槟方中去甲异波尔定和波尔定碱在正常和POI模型大鼠体内的药动学过程具有显著性差异,二者在POI模型大鼠体内的吸收效果更好,消除速率更缓慢,生物利用度更高,更有利于抗炎、促胃肠动力药效作用的发挥。4.去甲异波尔定及波尔定碱与大鼠血浆蛋白的结合属中等强度,且呈一定的浓度依赖性,且波尔定碱在POI模型大鼠中的血浆蛋白结合率显著低于正常大鼠,提示去甲异波尔定及波尔定碱在临床应用时需注意药物与血浆蛋白竞争结合产生的相互作用,且需根据病理状态调整剂量。综上所述,本文建立了香槟方中主要的生物碱成分的体内外定量分析方法,并对香槟方中去甲异波尔定和波尔定碱的药代动力学特征及血浆蛋白结合率进行了较系统的研究,为香槟方的质量控制和临床用药合理性提供一定的参考依据。