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本研究以水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)一年生枝为试材,建立了茎形成层愈伤组织诱导、扩繁和不定芽再生体系。克隆形成层愈伤组织芽再生过程中特异性表达基因FmPHV和上游启动子区域,进行生物信息学分析;进一步通过转基因并结合再生过程关键基因表达特性确定过表达FmPHV对再生的作用。本研究为水曲柳的繁殖利用和离体再生机制研究奠定了基础。主要内容如下:1.水曲柳茎段形成层的获得和愈伤组织诱导培养:(1)影响形成层培养因素研究:研究了 IBA、IAA、蔗糖渗透压变化和毒莠定、低温等因素处理对水曲柳茎段形成层获得和愈伤组织启动的影响,在寒冷和高浓度IBA溶液双处理下,形成层愈伤组织的启动率高达83.0%并表现出优于其他处理组合的增殖活性。选出得到形成层细胞先与培养基直接接触培养后间接接触培养、先低琼脂浓度培养高琼脂浓度培养的培养方式有利于愈伤组织形成。(2)形成层的获得和培养技术的建立:于5月-7月取水曲柳当年生枝条用50mg/L IBA溶液4℃处理22h后,23～25℃下再用0.5mg/L IBA溶液处理15min,剥取树皮。将树皮朝上置于MD201培养基中暗培养7d后,再将木质部完全去除后将靠近韧皮部一侧置于MD201培养基上,暗培养7d后,光培养14d可获得形成层愈伤组织。石蜡切片和中性红染色结果显示愈伤组织来源于形成层,并且愈伤组织细胞与形成层细胞都具有富含小液泡的特点,可作为鉴定干细胞的形态学依据。(3)形成层愈伤组织双层继代培养技术的建立:将形成层愈伤组织置于含有TSA、毒莠定和6-BA的D1培养基,光强为80μmol·m2·s-1,培养21d后转入表面滴加无激素WPM液体培养基(WB1)的MD201培养基中,双层培养21d,获得的松散愈伤组织可以于MD201固体培养基中继续继代,也可以转入添加0.5mg/L TDZ+lmg/L毒莠定的WPM液体培养基液体培养基中,进行悬浮培养继代。2.形成层愈伤组织的不定芽分化技术的建立:在WPM大量元素和钙盐为普通WPM培养基的二倍,其余组份正常的G2培养基(WPM+3.5mg/L6-BA+1 mg/L毒莠定+lmg/L TDZ+0.5mg/L TSA+7g/L 琼脂+20g/L 蔗糖)中,光强 80μmo1·m2·s-1 下培养28d后形成层愈伤组织分化形成芽原基结构,分化率为3.3%。3.克隆获得了水曲柳PHV基因,并命名为FmPHV。FmPHV编码区全长为2112bp,具有完整的开放阅读框,编码蛋白由703个氨基酸构成。FmPHV基因时空表达结果表明,FmPHV在水曲柳植株中在六月份整体表达量最高,在芽和形成层愈伤组织中的表达量较高。在4℃和ABA双胁迫下,FmPHV表达量显著升高。4.过表达FmPHV水曲柳的获得及FmPHV对芽再生作用分析。构建prokII-PHV-GUS-稳定侵染载体,采用农杆菌介导法转化下胚轴,通过再生培养基(WPM+5.6g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.8mg/L TDZ,pH=5.8)获得FmPHV过表达水曲柳转基因植株。对FmPHV过表达水曲柳中基因的表达量测定结果表明,在FmPHV高表达后,其下游基因MP(MONOPTEROS/AUXIN RESPONSE FACTOR5)表达量显著高表达。同时利用pA 7:PHV-GFP对实生苗瞬时侵染发现对生长素、细胞分裂素、芽再生关键基因的表达等均有促进作用,说明FmPHV在植物发育与芽再生通路中的重要作用。5.克隆获得FmPHV基因上游启动子序列,序列长2357bp,启动子中含有多个与组织部位特异性表达相关的元件,激素调控应答元件,胁迫应答元件等顺式作用元件。利用启动子载体Px-PHV-GUSp对水曲柳21d实生苗进行瞬时侵染,GUS染色结果表明FmPHV启动子在水曲柳特异性生长旺盛的部位表达活性较高。