论文部分内容阅读
乙酰化是除磷酸化之外另一种重要的蛋白翻译后修饰形式,底物蛋白的可逆乙酰化由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化。这两种酶可调控许多种类蛋白的乙酰化修饰,包括组蛋白、转录因子、细胞骨架和信号通路蛋白等。而且,这些HATs介导的乙酰化具有多种功能来控制细胞内的调控途径,如细胞周期调控、DNA修复、核运输和微管形成。近年来,关于病毒(尤其是慢病毒与DNA肿瘤病毒)利用细胞内乙酰化途径调控特异的宿主和/或病毒基因,进而激活病毒启动子完成病毒复制的报道逐渐增多。人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、人T细胞白血病病毒(HTLV-1)和原型泡沫病毒(PFV)的反式激活因子Tat、Tax和Tas可被不同HATs乙酰化,并促进了它们的反式激活功能。因此,病毒蛋白的乙酰化在其复制和生活周期中具有关键作用。
泡沫病毒(FV)是一种特殊而复杂的反转录病毒,属反转录病毒科中的泡沫病毒亚科。FV具有广泛的宿主范围,从猫、牛、马到灵长类动物均可感染。然而,至今在体内尚无FV感染与疾病有紧密联系的证据。FV在tas基因和erv基因的3端之间具有第二个启动子,称为内部启动子(IP),这一特性使得FV与其它仅有LTR启动子的反转录病毒有着明显的区别。
PFV的Tas蛋白是其反式激活因子,在病毒转录激活中具有核心地位,研究发现其具有乙酰化修饰现象,且乙酰化增强Tas结合LTR的水平,进而促进转录起始。牛泡沫病毒BFV于1983年从牛体内首次分离到,对BFV基因组进行遗传学分析表明,这一非灵长类FV与PFV之间具有相似的基因组结构。Btas蛋白含有249个氨基酸,可结合LTR和IP并激活转录。在BFV生活周期中,其反式激活因子Btas蛋白可能起到中心调控因子和潜伏-裂解感染转换开关的作用,但其详细机制有待深入探讨。因此,PFV Tas的乙酰化现象,在BFV中是否同样存在,乙酰化Btas的HATs有哪几个,以及乙酰化功能和调控机制与Tas的异同又如何,这些问题的阐明有利于从另一角度对泡沫病毒复制调控的机制进行比较与研究。
在本文中,我们对于Btas的乙酰化修饰和乙酰化后的功能进行研究。通过免疫沉淀实验,我们发现在体内p300可特异性乙酰化Btas。随后,为研究Btas是否在体外也是乙酰化的,我们构建了体外乙酰化系统,此系统可高效地乙酰化组蛋白H3。随后通过此体外实验,我们发现p300 HAT区蛋白能在体外乙酰化Btas。位于第66、109和110位的赖氨酸是p300乙酰化Btas的底物氨基酸。与野生型相比,Btas乙酰化突变体的亚细胞定位没有差异。然而,乙酰化赖氨酸突变致使Btas不能激活LTR和IP启动子。随后本文对DNA结合能力是否受Btas乙酰化影响进行分析,发现p300的乙酰化增强了Btas的DNA结合能力。有趣的是,Btas的乙酰化突变体(K66/109/110R)不能结合于BFV LTR的DNA应答元件。进一步凝胶阻滞实验的结果显示,K110对Btas结合DNA是必须的,而Btas DNA结合水平的提升应主要源于K66和K109的乙酰化。上述结果表明乙酰化赖氨酸对Btas的反式激活功能是十分重要的,而且p300介导的Btas乙酰化应参与了BFV的转录起始与病毒复制。
先前报道表明PFV Tas蛋白与PCAF和p300有相互作用,前者还使Tas发生乙酰化。因此,本文分析了其它两种HATs,即CBP和GCN5对Tas转录激活的影响。在萤火虫荧光素酶实验中,我们发现Tas与CBP/GCN5可协同激活PFVLTR。另一方面,GCN5激活PFV IP也呈现出剂量依赖效应,但CBP对Tas激活IP影响不大。随后,通过将Tas与各种HATs共转染并进行免疫沉淀实验,鉴定到p300也可乙酰化Tas,但其乙酰化水平比PCAF要低。这些结果暗示Tas可能被不同的HATs乙酰化,进而有利于其行使反式激活功能。总体而言,p300对两种反式激活因子的功能均有促进作用。从乙酰化修饰来说,PFV Tas和BFVBtas均可被p300乙酰化,但在后者中,p300是Btas的主要乙酰化酶,而p300虽可乙酰化。Tas,其乙酰化程度低于PCAF对Tas的乙酰化水平,体现出这两种FV对HATs的偏好性是不同的。
HIV-1的反式激活因子Tat同样存在乙酰化修饰,多种HATs可以Tat为底物,乙酰化不同的赖氨酸,并使Tat产生不同的功能变化,目前对其乙酰化调控机制已了解得较为清楚。对于Tat乙酰化功能的研究,多是基于参考株Tat开展的。与Env相比,虽然。Tat的变异较少,但仍具有一些潜在的涉及功能的突变。HIV-1流行株Tat是否与参考株在乙酰化方面有所不同,这些差异能否反映在Tat的功能上,进而影响HIV-1的感染性与传播,同样值得探讨。据此,本文从天津地区获得HIV-1携带者的血液样本,并首先构建了感染性克隆,称为HIV-1天津株。随后,本文克隆得到天津株Tat,随同克隆了源于另一美国感染者淋巴结组织(LN)、基底神经节组织(BG)和脑膜组织(MG)的Tat,对它们的激活水平进行对比,发现这些Tat对HIV-1 LTR的激活均比参考株HXB2的Tat高,仅有BG的Tat激活偏低。值得注意的是,天津株Tat对于NF-kB的激活明显强于参考株,而且其也被p300,CBP,PCAF和GCN5等HATs乙酰化。序列比对的结果显示这四株Tat含有赖氨酸突变(如T40K),是潜在的乙酰化位点,这些突变可能与这些Tat的乙酰化水平、病毒的致病性与流行有关。
综上所述,我们对于反转录病毒调控蛋白的乙酰化机制进行了初步研究。对FV和HW-1之间乙酰化途径的异同点进行比较,有助于我们了解乙酰化在病毒复制、病毒宿主相互作用中的重要功能。根据含不同赖氨酸突变的Tat具有较高激活能力这一现象,本文推测病毒蛋白的乙酰化与HW-1流行性之间可能具有潜在的相关性。