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H5N1 亚型高致病禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是一种急性、高度接触性的禽类传染病,该病是由A型流感病毒引起的。血凝素HA作为禽流感病毒的主要保护性抗原,在其抗原性和致病性中发挥重要作用。启动子是制约重组杆状病毒在细胞中表达的主要因素之一,强启动子的使用能够增强外源基因的表达效率。CMV启动子和WSSV ie1启动子都是公认的强启动子,在哺乳动物细胞和昆虫细胞中各有优势,能够高效启动外源基因的表达。本课题将H5N1型禽流感病毒HA基因分别克隆到由CMV启动和WSSV ie1启动的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等调控元件的两组杆状病毒转移载体中,通过Bac-to-Bac系统获得重组Bacmid DNA;通过对Sf9昆虫细胞的转染,收获两组重组杆状病毒;利用重组杆状病毒进一步侵染鸡胚成纤维细胞,进行SDS-PAGE和Western blotting分析,比较HA基因在禽类细胞中的表达水平;将携带HA基因的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫试验,将目的抗原基因高效地传递到家禽细胞中,使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的细胞免疫应答;比较分析各组重组杆状病毒的表达时间及免疫效果的差异,筛选出更高效的启动子和最佳的杆状病毒转移载体,以便为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定基础。参照genebank上已发表的H5N1型禽流感HA基因的序列设计引物,将组氨酸标签融合于HA基因的5’端,通过PCR扩增HA基因并将其克隆到pMD18-T载体上,经酶切鉴定及序列测定后证明获得了含HA基因的阳性重组质粒pT-HA。将组氨酸标记的HA基因分别克隆至含CMV启动子的转移载体pS、pS-ITRs、pS-con 和含 WSSV ie1 启动子的 pAQ、pAQ-ITRs、pAQ-con 中,经组合酶切鉴定,证明成功获得了重组转移载体pS-HA、pS-ITRs-HA、pS-con-HA及pA-HA、pA-ITRs-HA、pA-con-HA。将重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得重组穿梭质粒rBac-S-HA、rBac-S-ITRs-HA、rBac-S-con-HA、rBac-A-HA、rBac-A-ITRs-HA 和rBac-A-con-HA。利用穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,利用获得的重组杆状病毒侵染鸡胚成纤维细胞,通过SDS-PAGE和Western-blotting成功检测到HA蛋白的表达。其中BV-S-HA、BV-S-ITRs-HA的蛋白表达量分别为BV-S-con-HA的2.43倍和2.67倍;BV-A-HA、BV-A-ITRs-HA的蛋白表达量分别为BV-A-con-HA的2.44倍和2.69倍。以6支重组杆状病毒和商品化疫苗作为试验组,设置阳性、阴性对照组,分别免疫接种SPF鸡,于14d、28d、42d、56d、70d对其翅下静脉取血,分离血清。采用ELISA法检测各试验组血清中IgG抗体水平,同时对鸡外周血T淋巴细胞增殖效应以及血清中IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子的含量进行测定,比较分析各组之间差异性。结果显示:由CMV启动的BV-A系列与由WSSV ie1启动的BV-S系列重组杆状病毒诱导的IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.05),BV-A系列抗体水平在第42天可达到1.242,显著高于商品化疫苗组及对照组;具有相同启动子的试验组中,同时含VSV-GED、WPRE、ITRs调控元件的试验组诱导产生的抗体显著高于不含任何调控元件的对照组。淋巴细胞增殖结果表明:由WSSV ie1启动的BV-A试验组淋巴细胞刺激指数最高可达1.349,明显高于由CMV启动的BV-S试验组和疫苗组(P<0.05);免疫血清中各细胞因子检测结果表明:加强免疫后第二周,各组免疫血清中各细胞因子含量相继达到峰值,其中细胞因子IL-2的含量最高可达99.13ng/L、细胞因子IL-4的含量最高可达82.42ng/L、细胞因子IFN-γ的含量最高可达66.93 ng/L。结果表明,由WSSV ie1启动的BV-A系列重组杆状病毒疫苗诱导鸡体产生的免疫效果显著强于由CMV启动的BV-S系列重组杆状病毒疫苗。本研究制备的基于杆状病毒载体的禽流感疫苗能够同时激发鸡体产生良好的体液和细胞免疫应答,将为禽流感疫苗的开发提供有益借鉴,同时也为禽流感的防治奠定基础。