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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。2006年,我国爆发了一场主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异毒株引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疾病,给养猪业带来毁灭性的打击,导致严重的经济损失。PRRSV基因组的高变异性以及其特殊的生物学特性是造成PRRSV难以防控的重要原因,所以监测PRRSV的变异情况、研究综合防控措施是防治PRRSV的关键手段。本研究对两株PRRSV进行了序列分析,构建了缺失Nsp2 B细胞抗原表位的PRRSV全长cDNA和单双片段重组杆状病毒表达载体,以期为PRRSV的序列监测和新型疫苗研制奠定一定的基础。
本研究从广东省两个发病猪场临床组织样本中分离到两株PRRSV,分别命名为ZS-GD和ZH-GD株。两株病毒均可在Marc-145细胞中稳定传代,并产生明显细胞病变(cytopathic effect,CPE);可与PRRSV荧光抗体结合,产生特异性荧光。对两株病毒的全基因组进行序列测定和结果分析表明:两株病毒均属于美洲型PRRSV,且在Nsp2上有30个氨基酸的缺失,与我国2006-2007年间多个省份分离的PRRSV变异株的各核苷酸序列和各蛋白氨基酸序列具有高度相似性,且遗传变异特征相同,推测可能来源于同一祖先。
PRRSV感染时机体内可以产生滴度很高的针对于Nsp2的抗体,许多Nsp2的B细胞表位已经被鉴定出来。本研究利用DNA star生物软件预测PRRSVXH-GD株Nsp2的B细胞抗原表位,并将预测出的表位与PRRSV BJ-4株Nsp2 B细胞抗原表位序列进行比对,最终筛选出5条比较保守的表位序列(73-86aa、385-394aa、437-451aa、452-466aa、467-477aa),利用PRRSV XH-GD株反向遗传操作平台,将预测出的5个Nsp2 B细胞表位分别进行缺失,通过酶切鉴定和序列测定表明,成功构建出5条Nsp2 B细胞表位缺失的XH-GD全长cDNA,为日后进一步探索PRRSV标记疫苗奠定了坚实的基础。
杆状病毒是目前一种应用十分广泛的载体,主要用于基因治疗和疫苗开发等领域,由于可容纳大的外源基因插入,使其成为一种合成病毒样颗粒的理想工具。本研究利用Bat-to-Bat表达系统,将PRRSV XH-GD株的ORF2a～ORF6分别插入到杆状病毒表达载体pFastBacTM1中,将ORF2a-ORF4、ORF2b-ORF3、ORF5-ORF6插入到杆状病毒表达载体pFastBacTM Dual中,构建杆状病毒单表达和双表达载体,通过酶切鉴定、观察细胞病变和间接免疫荧光实验证明,单片段和双片段重组杆状病毒构建成功,为PRRSV各结构蛋白功能的进一步深入研究和PRRSV病毒样颗粒的探索做了必要的准备。