【摘 要】
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心血管疾病严重威胁着人类健康,其死亡率已跃居疾病死亡原因的首位。因此,亟需找到有效的治疗方式。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有无限增殖、多向分化潜能等特征,因此在再生医学领域具有巨大的潜力。利用胚胎干细胞诱导的心肌细胞,可应用于疾病模型诊断、药物筛选和心肌修复,作为潜在的高效细胞治疗手段,其具有非常广阔的应用前景。然而,利用人胚胎干细胞诱导产生的心肌细胞(Hum
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心血管疾病严重威胁着人类健康,其死亡率已跃居疾病死亡原因的首位。因此,亟需找到有效的治疗方式。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有无限增殖、多向分化潜能等特征,因此在再生医学领域具有巨大的潜力。利用胚胎干细胞诱导的心肌细胞,可应用于疾病模型诊断、药物筛选和心肌修复,作为潜在的高效细胞治疗手段,其具有非常广阔的应用前景。然而,利用人胚胎干细胞诱导产生的心肌细胞(Human embryonic stem cell derived cardiomyocytes,hESC-CMs),还存在心肌分化效率低、亚型不均一以及心肌细胞成熟度低等问题。视黄酸(Retinoic acid,RA)信号通路在心脏发育过程中具有多重作用。前期数据结果表明,与视黄酸合成相关的基因Stra6在老鼠发育的中胚层特异性表达。在此基础上,我们首先采用人的心肌细胞定向分化系统,研究显示STRA6在中胚层和跳动后均高表达,表明其在中胚层和心肌成熟过程中可能发挥重要作用。因此,本课题系统的研究了视黄酸在心肌分化和成熟过程中的作用,为干细胞的临床转化应用提供了新的方法。我们通过在心肌分化过程中的不同时间段进行RA处理,系统地研究了RA通路在心肌分化和成熟过程中的作用。利用实时荧光定量PCR发现,视黄酸在第2-4天处理能显著的促进侧板中胚层的分化,进而促进下游谱系心肌细胞的特异性基因TNNT2,NKX2.5和MYH6的表达。流式细胞术结果表明,视黄酸处理后的心肌细胞比例显著提高;同时,心房肌标志分子MYL7和SLN明显增加,表明RA主要促进心房肌细胞的分化。为了研究RA对心肌细胞成熟的作用,我们通过代谢筛选的方法对定向分化的心肌细胞,进行了纯化,然后在不同时间段添加视黄酸。结果表明,与心肌细胞结构性成熟有关的基因表达显著上调。我们通过免疫荧光、膜片钳和能量代谢的实验方法分别从结构、电生理和代谢这三个方面揭示视黄酸处理能诱导心肌成熟。实验结果表明,视黄酸在心肌跳动后的第15-20天处理显著的增加细胞面积、肌小节的长度、多核率和线粒体拷贝数。在电生理水平上,膜片钳结果表明视黄酸处理后的心肌细胞的APD50、APD90明显提高。更重要地,视黄酸处理后的心肌细胞的糖酵解能力下降,线粒体氧化磷酸化水平增加,同时能更加有效的利用脂肪酸和丙酮酸作为能量来源。上述研究结果表明,在心肌分化的早期时间窗(第2-4天)进行视黄酸处理,能够促进侧板中胚层的分化,进而提高心肌细胞的分化效率;在心肌跳动之后的第15-20天进行视黄酸处理,能有效的促进心肌细胞的结构、电生理和代谢成熟。视黄酸在心肌分化过程中的作用为心肌细胞的分化效率和心肌质量的提高提供了新的思路。
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