论文部分内容阅读
犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆、表达及其间接ELISA方法的建立摘要犬瘟热是由犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus，CDV)感染所引起的一种急性、高度接触性传染病。本研究利用PCR技术扩增出CDVLP株N基因，进行克隆，成功实现了N基因在大肠杆菌中的表达。对表达的重组蛋白进行初步纯化，利用纯化的N基因重组蛋白初步建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法。1.根据GenBank中报道的CDVOnderstepoort株基因序列，设计了一对特异性引物，用该引物对分离的LP野毒株的N基因进行了RT-PCR扩增，得到1572bp的PCR片段，纯化后与克隆载体相连，构建pGEM-N，用于核苷酸序列测定并进行遗传进化分析。2.根据GenBank中报道的CDVOnderstepoort株基因序列，又设计了一对N基因特异性引物，将扩增得到的559bp的PCR片段纯化后与克隆载体相连，构建pMD18-N，用于核苷酸序列测定。将pMD18-N双酶切，回收目的片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中，构建重组质粒pET-28N，将其转化大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导表达。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳，可检测到相对分子量约25KD的重组蛋白。免疫印迹证实该重组蛋白可与CDV多克隆抗体发生特异性反应。3.利用表达的核蛋白的重组融合蛋白作为抗原，建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法。结果表明：抗原的最适包被浓度为1ug/ml，最适包被条件为37℃1小时4℃过夜，待检血清稀释度为1∶400，HRP-山羊抗犬IgG的工作浓度为1∶4000。建立的ELISA方法特异性高，重复性好，敏感性强。