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转移是导致结肠癌预后不良的关键问题,超过三分之一的结肠癌患者最终会发生转移，给临床治疗带来极大困难，严重影响患者的疗效和生存质量。上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）是导致肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤。最新的研究显示EMT是肿瘤转移的关键启动步骤，而EMT在结肠癌进展中发挥着主导作用。深入研究结肠癌EMT发生的分子机制，寻找可以逆转结肠癌EMT的重要分子靶点，在关键步骤对结肠癌转移进行干预，理论上可更有效抑制结肠癌转移。目前已经发现了多个与结肠癌EMT与转移相关的分子，丰富了我们对于该领域的理论认识。然而，EMT相关信号通路涉及多个分子多条信号通路，任何针对单个分子的干预方法，都难以达到理想的逆转效果。因此，有必要寻找新的手段和策略。miRNA是近年来发现的一类重要的内源性非编码小RNA分子，其与肿瘤的发生发展密切相关。最近研究表明，miRNA可以通过负性调控EMT相关基因的表达，在肿瘤转移中起着重要的作用。由于单个miRNA可以同时调控多个靶基因的表达，靶向miRNA的干预理论上能更有效的逆转肿瘤EMT表型。然而，到目前为止，仅有少数miRNA被证实参与了肿瘤EMT的发生，miRNA在肿瘤尤其是结肠癌EMT中所起的作用及其分子机制还远未阐明。【目的】探讨miRNA在结肠癌EMT中的调节作用及其分子机制，以期阐明结肠癌EMT机制，为干预结肠癌转移提供新的理论依据。【方法】1.利用免疫荧光、real-time RT-PCR及western blotting技术鉴定多种结肠癌细胞系EMT表型，筛选结肠癌EMT表型差异细胞模型；2.采用MiRNA芯片技术筛选结肠癌EMT相关的差异表达miRNA分子，并利用real-time RT-PCR对miRNA芯片结果进行验证；3.收集结肠癌组织标本，采用real-time RT-PCR检测候选miRNA的表达，并探讨其表达水平与临床病例参数的关系；4.采用transwell实验检测候选miRNA对结肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响，采用免疫荧光、real-time RT-PCR及western blotting技术检测候选miRNA对细胞骨架与EMT相关标志分子表达的影响；5.采用生物信息学预测候选miRNA的潜在靶基因，并进一步利用Westernblotting、qRT-PCR和双荧光素酶报告基因实验进行验证；6.采用免疫组织化学技术检测靶基因在结肠癌标本中的表达，并探讨其与临床病理参数之间的相关性；7.采用transwell实验、免疫荧光染色、real-time RT-PCR及western blotting技术验证靶基因对结肠癌EMT表型的影响。【结果】1、结肠癌高低转移细胞系SW480和SW620具有明显的EMT表型差异。SW480和SW620是一对具有相同遗传背景的结肠癌高低转移细胞系。免疫荧光染色结果显示，相对于SW480细胞，SW620细胞骨架呈明显的间质样形态，上皮标志分子E-cadherin分子的表达明显下调；Western blotting和real-time RT-PCR结果显示SW620间质标志分子Vimentin表达明显上调，E-cadherin表达明显下调。2、EMT相关的miR-185在结肠癌中明显下调，并与结肠癌进展密切相关。EMTmiRNA芯片筛选（SW480和SW620）获得了多个与结肠癌EMT相关的差异表达miRNA分子，其中miR-185是在SW620中下调最明显的分子；real-time RT-PCR结果表明miR-185在SW620中明显下调，与芯片结果一致，在90例结肠癌临床标本中，miR-185的表达水平与结肠癌患者的淋巴结转移状况以及TNM分期显著相关。3、miR-185抑制结肠癌细胞侵袭和迁移能力，逆转EMT表型。在SW480中抑制miR-185的表达和在SW620细胞中升高miR-185的表达后进行transwell实验，结果表明miR-185可以明显抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。此外，在SW620中过表达miR-185后，免疫荧光染色显示SW620细胞骨架形态由间质样变为上皮样，Western blotting和real-timeRT-PCR结果显示SW620细胞中上皮标志分子的表达明显上调，间质标志分子的表达明显上调。4、间质交互分子1（STIM1）是miR-185的直接功能靶基因。采用多个生物信息学软件预测miR-185的潜在靶基因，取交集，并进行功能聚类分析和通路分析，初步选定钙信号关键分子STIM1为miR-185的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示miR-185可以通过直接结合于STIM1mRNA的3’UTR抑制荧光素酶活性。Western blotting和qRT-PCR结果显示相对于SW480，STIM1在SW620细胞系中明显上调。此外，在SW480中抑制miR-185的表达，STIM1的表达随之上调，在SW620细胞中升高miR-185的表达后，STIM1的表达随之下调。补救实验显示在SW620细胞中，3’UTR突变的STIM1表达载体可以逆转miR-185的表型抑制效应，说明STIM1是miR-185发挥功能的主要靶基因。5、STIM1在结肠癌标本中过表达，其表达水平与miR-185水平呈负相关，并与结肠癌进展密切相关。采用免疫组化染色检测STIM1在上述90例结肠癌标本中的表达，结果显示，相对正常的癌旁组织，STIM1在结肠癌标本中的表达明显上调，统计学分析发现，STIM1的表达水平与miR-185水平呈负相关，并与结肠癌淋巴结转移状况及TNM分期显著相关。6、STIM1促进结肠癌细胞粘附、侵袭与迁移能力，诱导EMT。在SW620细胞中用特异性的小干扰RNA下调STIM1的表达后，粘附实验和transwell实验结果显示，细胞的粘附、侵袭与迁移能力明显减弱，免疫荧光、western blotting和qRT-PCR结果显示，细胞的EMT表型被逆转。【结论】1、多个miRNA在结肠癌EMT表型差异细胞模型中呈差异表达，可能在结肠癌EMT中起重要作用；2、miR-185参与调控结肠癌EMT表型，其分子机制可能是：miR-185通过负性调控靶基因STIM1的表达，从而影响结肠癌细胞钙离子信号的失调，继而引起下游信号通路的异常，从而导致EMT表型的改变；3、miR-185及其靶基因STIM1在结肠癌组织的表达水平与结肠癌进展密切相关，二者可能成为新的结肠癌分子标志物。