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实验目的： 在本研究中我们检测了子宫内膜癌细胞系、卵巢癌细胞系以及HEK293T细胞系中PDCD4和TRIM27的表达情况，利用体外实验研究TRIM27干扰和过表达后对PDCD4表达的影响以及TRIM27调控PDCD4的作用机制。 实验方法： 1.PDCD4和TRIM27在子宫内膜癌细胞系、卵巢癌细胞系以及293T细胞系中的表达 利用qRT-PCR方法检测PDCD4和TRIM27在子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1-A、KLE、RL95-2，卵巢癌细胞系A2780以及293T细胞系中mRNA水平的表达情况;利用western blot方法检测PDCD4和TRIM27在上述细胞系中蛋白水平的表达情况。 2.PDCD4和TRIM27在子宫内膜癌细胞系、卵巢癌细胞系以及293T细胞系中的表达分布 利用细胞免疫荧光双染的方法检测PDCD4和TRIM27在子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1-A、KLE、RL95-2，卵巢癌细胞系A2780以及293T细胞系中的表达和细胞中的定位。 3.TRIM27过表达及干扰对PDCD4mRNA水平的影响 在Ishikawa、A2780、293T细胞中转染TRIM27的特异性siRNA，转染24h后用qRT-PCR的方法检测TRIM27的干扰效率和PDCD4的表达情况;在Ishikawa、293T细胞中转染TRIM27过表达载体，转染24h后用qRT-PCR的方法检测TRIM27的过表达效率和PDCD4的表达情况。 4.TRIM27过表达及干扰对PDCD4蛋白水平的影响 在Ishikawa、A2780、293T细胞中转染TRIM27的特异性siRNA，转染48h后用western blot的方法检测TRIM27的干扰效率和PDCD4的表达情况;在Ishikawa、293T细胞中转染TRIM27过表达载体，转染48h后用western blot的方法检测TRIM27的过表达效率和PDCD4的表达情况。 实验结果： 1.TRIM27和PDCD4在蛋白水平的表达存在明显的负相关的关系，在mRNA水平没有明显的相关性 荧光定量PCR结果显示，在Ishikawa、HEC-1-A、KLE、RL95-2、A2780、细胞系中，TRIM27和PDCD4的表达在mRNA水平没有明显的相关性。 Western blot结果显示在Ishikawa、HEC-1-A和293T细胞系中存在TRIM27的相对低表达和PDCD4的相对高表达;在KLE、RL95-2细胞系中存在TRIM27的相对高表达和PDCD4的相对低表达。因此，TRIM27和PDCD4在蛋白水平的表达存在明显的负相关的关系。 2.TRIM27和PDCD4在细胞中的表达分布存在共定位的现象 利用细胞免疫荧光双染的方法检测了细胞中TRIM27和PDCD4的表达分布情况，结果显示在Ishikawa、HEC-1-A、RL95-2、KLE以及A2780细胞中PDCD4主要分布在细胞核周围，TRIM27在细胞核内和细胞核周围都有表达，在空间位置上PDCD4和TRIM27存在共定位的现象;在293T细胞中PDCD4主要分布在细胞核周围，TRIM27也主要表达在细胞核周围，在空间位置上PDCD4和TRIM27存在共定位的现象。 3.TRIM27对PDCD4mRNA水平的表达没有明显的影响 在Ishikawa细胞、293T细胞、A2780细胞中转染TRIM27的特异性siRNA，qRT-PCR结果显示，在干扰TRIM27后，PDCD4在mRNA水平有上调的趋势;在Ishikawa细胞、293T细胞中转染TRIM27的过表达质粒，qRT-PCR结果显示，在过表达TRIM27后，PDCD4在mRNA水平没有明显变化。因此TRIM27对PDCD4mRNA水平的表达没有明显的影响。 4.TRIM27对PDCD4蛋白水平有明显的负调控作用 在Ishikawa细胞、293T细胞、A2780细胞中转染TRIM27的特异性siRNA，western blot结果显示，在干扰TRIM27后，PDCD4蛋白水平明显上调;在Ishikawa细胞、293T细胞中转染TRIM27的过表达质粒，western blot结果显示，在过表达TRIM27后，PDCD4蛋白水平明显下调。因此，在蛋白水平，TRIM27对PDCD4有明显的负调控作用。 5.TRIM27可以促进PDCD4蛋白的降解 利用TRIM27特异性siRNA转染卵巢癌细胞系A2780，转染24h后收取蛋白，在收蛋白前6h、4h、2h、0h分别加CHX刺激阻断蛋白质的合成途径，观察PDCD4蛋白的降解情况。Western blot结果显示，在干扰TRIM27后，PDCD4表达明显上调;在加入CHX阻断蛋白质的合成后，干扰TRIM27组和对照组相比，PDCD4降解速度减慢，说明TRIM27具有促进PDCD4蛋白质降解的作用。 利用TRIM27的过表达质粒转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa，转染24h后收取蛋白，在收蛋白前6h、4h、2h、0h分别加CHX刺激阻断蛋白质的合成途径，观察PDCD4蛋白的降解情况。Western blot结果显示，在过表达TRIM27后，PDCD4表达下调;在加入CHX阻断蛋白质的合成后，过表达TRIM27组和对照组相比，PDCD4降解速度加快，说明TRIM27具有促进PDCD4蛋白质降解的作用。 6.TRIM27可以促进PDCD4通过泛素-蛋白酶体途径降解 利用TRIM27的过表达质粒分别转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa和293T细胞，转染24h后收取细胞蛋白，在收取细胞蛋白前6h、4h、0h分别加入MG132刺激阻断蛋白酶体途径的降解，观察PDCD4的表达情况。Western blot结果显示，与对照组相比，在过表达TRIM27后，PDCD4表达下调;在过表达TRIM27后分别加MG132刺激4h、6h时，发现PDCD4表达和未加刺激组相比有一个回升，并且刺激6h的比刺激4h的上调的要多。在阻断蛋白酶体途径的降解后，TRIM27对PDCD4的降解作用消失，说明TRIM27是通过促进PDCD4泛素-蛋白酶体途径降解来实现对PDCD4的负调控作用。 7.TRIM27可以促进PDCD4的泛素化作用 利用TRIM27的特异性siRNA转染卵巢癌细胞系A2780，24h后转染泛素-HA过表达质粒，24h后收取蛋白;采用免疫共沉淀的方法检测PDCD4泛素化水平的变化，western blot结果显示在干扰TRIM27后，PDCD4的泛素化水平下调，说明TRIM27可以促进PDCD4的泛素化。 利用TRIM27的过表达质粒和泛素-HA过表达质粒共同转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa，24h后收取细胞蛋白;采用免疫共沉淀的方法检测PDCD4的泛素化水平的变化，western blot结果显示在过表达TRIM27后，PDCD4的泛素化水平上调，说明TRIM27可以促进PDCD4的泛素化。 8.TRIM27可以促进PDCD4K48位点和K63位点的泛素化 利用TRIM27过表达质粒和K48-HA过表达质粒;TRIM27过表达质粒和K63-HA过表达质粒分别共同转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa，24h后收取细胞蛋白;采用免疫共沉淀的方法检测PDCD4K48位点、K63位点的泛素化水平变化，western blot结果显示在过表达TRIM27后PDCD4K48位点和K63位点的泛素化水平均上调，说明TRIM27可以促进PDCD4K48位点和K63位点的泛素化。 实验结论： 1.在子宫内膜癌细胞系和293T细胞系中，TRIM27和PDCD4在蛋白水平存在负相关的关系。 2.在子宫内膜癌细胞系、卵巢癌细胞系以及293T细胞系中，TRIM27和PDCD4在细胞中的表达存在共定位关系。 3.TRIM27对PDCD4mRNA表达没有明显影响，但TRIM27对PDCD4蛋白表达具有明显的负调控作用。 4.TRIM27可以促进PDCD4通过泛素-蛋白酶体途径降解。 5.TRIM27能够促进PDCD4发生泛素化修饰。 6.TRIM27可以促进PDCD4K48位点和K63位点的泛素化。 7.TIRM27可通过RING finger结构域发挥对PDCD4的调控作用。 创新性及意义 1.在本论文中，我们首次发现TRIM27对PDCD4蛋白具有调控作用，并发现TRIM27通过促进PDCD4的泛素化降解发挥对PDCD4的调控。 2.本论文的研究结果可能为临床上肿瘤的治疗提供一个新的靶点。 论文的不足之处 1.本论文在研究PDCD4泛素化位点时，发现TRIM27不仅可以促进PDCD4K48位点泛素化，还可以促进PDCD4K63位点泛素化，对于K63位点泛素化的作用需要进一步探讨。 2.本论文对于TRIM27RING finger结构域在TRIM27发挥E3泛素连接酶时的作用需要进一步探讨。