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目的:1.建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探索小胶质细胞的来源。
2.探讨芹菜素对局灶性大鼠脑缺血/再灌注损伤半暗区小胶质细胞的影响及意义。
方法:采用线栓法建立大鼠脑缺血(2h)及不同时间再灌注损伤模型。动物随机分为假手术组(Sham-operated,S,n=13)、模型组(Model,M,n=65)和芹菜素组(Apigenin,A,n=65)。M组和A组按再灌注时间不同又分为再灌注6h组(M6h,A6h,n=13)、24h组(M24h,A24h,n=13)、48h组(M48h,A48h,n=13)、72h组(M72h,A72h,n=13)、7d组(M7d,A7d,n=13),各5小组,共11小组。在制作MCAO模型时和制作后的12h尾静脉各注射一次罗丹明6G(Rhod6G)。A组于再灌注同时及其后的每24h腹腔注射11.6×10-3 mol/L芹菜素溶液25mg/kg(0.8ml/100g),S组和M组在相同的时间注射等体积生理盐水。各组动物麻醉清醒后及处死前均给予神经行为学评分。每组大鼠各6只观察至规定时间予颈椎脱臼处死,取左侧大脑半球(缺血再灌注侧)测脑组织含水量与MDA含量。此外,每组1只大鼠经心脏灌注后做脑组织切片,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死灶。每组6只大鼠心脏灌注固定后凝集素荧光(FITC-ILB4)组化染色激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)观察浸润的单核细胞及半暗区小胶质细胞(microglia MG)形态及数量等的变化情况。
结果:1.神经行为学评分:S组为0。M组在脑缺血再灌注后72h、7d神经行为学评分较6h和24h均有显著减小,差别有高度显著性意义(P<0.01)；M组在脑缺血再灌注后48h神经行为学评分较再灌注6h有减小,差别有显著性意义(P<0.05)。A组在脑缺血再灌注后7d神经行为学评分较6h和24h均有显著减小(P<0.01),A组在再灌注后72h神经行为学评分较再灌注24h有减小(P<0.05)。A组与M组各相应时间点除6h外,神经行为学评分均有减小(P<0.05)。余各相应时间点间比较无统计学意义。
2.脑组织切片TTC染色:S组脑片均红染,未见白色梗死灶形成:M6h组出现白色梗死灶,位于颞项叶皮层和尾壳核；之后的42小时梗死灶范围逐渐扩大,M48h组可见较大的尾壳核和额颞顶叶皮层梗死灶的融合,明显大于M6h、M24h组、M72h组及M7d组:A组梗死灶较相应时间M组均有不同程度的减小,主要表现在皮层。
3.脑组织含水量变化:与S组相比,M组及A组大鼠平均脑含水量在6h时即明显升高,72h时达到高峰(P<0.01),7 d时两组大鼠的脑含水量基本恢复正常,与S组相比无明显差异(P>0.05)。而A组较M组相应各时间点脑组织含水量均有下降,尤以A48h、A72h组较M组相应时间点下降明显(P<0.01),差异有显著统计学意义。
4.脑组织MDA含量的变化:与S组比较,M组和A组各时间点MDA含量均有升高(P<0.01),M72h组明显高于M6h、M24h和M7d组,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；A48h组和A72h组与相应M组比较有显著降低(P<0.01或P<0.05),差异有统计学意义。
5.CLSM观察MCAO后脑内单核细胞的浸润及半暗区小胶质细胞数量和形态的变化:MCAO后6h至7d脑内均存在ILB4+/Rhod6G+细胞的浸润,提示缺血后的大脑实质内一部分小胶质细胞来源于循环中的单核细胞。M组与A组ILB4+细胞数较S组均明显增高(P<0.01),于半暗区聚集；A组与M组各相应时间点半暗区ILB4+细胞数比较,A组均低于M组(P<0.05),芹菜素存一定程度上抑制了小胶质细胞的活化。S组MG形态上呈现高度分枝状。M组和A组随着再灌后时间的延长,MG逐渐活化,形态由分枝状向阿米巴样转变,至48h时各组MG形态均以阿米巴样为主。
6.半暗区内固有小胶质细胞与浸润细胞计数的比值进行比较:半暗区内固有小胶质细胞与浸润细胞计数的比值即ILB4+/Rhod6G-/ILB4+/Rhod6G+进行比较,M组与A组均以72h时比值最高,提示半暗区小胶质细胞的聚集以脑内固有小胶质细胞的增生为主,其中M72h组较M6h、M24h比值明显增高(P<0.05),差异有统计学意义。A48h、A72h、A7d组较A6h、A24h组比值增高(P<0.01),差异有显著统计学意义；A72h组较A7d组比值增高(P<0.01),差异有显著统计学意义。
7.相关性分析:半暗区小胶质细胞数量与脑组织MDA含量呈正相关(r=0.518,P<0.01)。
结论:1.缺血后大脑实质内一部分小胶质细胞来源于循环中浸润的单核细胞(Rhod6G+)；
2.急性缺血再灌注脑组织半暗区小胶质细胞数量的增高,与脑MDA含量密切相关；
3.芹菜素可抑制半暗区小胶质细胞的聚集,减少活化小胶质细胞的数量,降低MDA含量及脑含水量,减轻脑水肿的程度,提示芹菜素在大鼠脑缺血再灌注损伤中的发挥着神经保护作用。