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蛋白质是生命活动所必须的物质之一,蛋白质正常的功能依赖于其正确的空间构象。已有报道表明,蛋白质的空间构象发生异常或被改变会导致聚集并产生淀粉样沉积,从而引发组织细胞及器官发生病变。目前已经发现和淀粉样纤维有关的人类疾病有二十多种,如老年痴呆,唐氏综合症,家族性淀粉样变性多发性神经组织疾病等。经研究证实,蛋白质淀粉样纤维可直接或间接诱导细胞组织及一些器官损害,从而导致细胞发生聚集、裂解和凋亡。目前对淀粉样纤维的致病机理仍不清楚,仍然没有有效的药物用于临床治疗,因此探索蛋白质淀粉样纤维化的分子机制及筛选相关抑制剂是很有意义的。本文以鸡蛋清溶菌酶作为研究的模型蛋白,对体内可能出现纤维种子,加快纤维生长的速度,以及不同种类的抑制剂在这类情况下的作用进行探索。首先从纯溶菌酶种子对溶菌酶纤维化作用的大小,探索种子的作用时间及方式；然后探索在不同剂量及不同种类抑制剂存在的条件下,种子对溶菌酶纤维化的影响；最后探索种子和二硫苏糖醇对溶菌酶纤维生长的不同时期所产生的作用。实验方法及结果：1.溶菌酶淀粉样纤维形成过程的动力学特征溶菌酶在pH为2.0,65℃的条件下孵育一定时间后可形成淀粉样纤维,该过程中,溶菌酶二级结构中的α螺旋结构减少,p折叠结构增加。ThT是一种荧光试剂,可以与淀粉样纤维中的β-折叠结构进行特异性结合,在特定的激发波长下可以发出荧光,且荧光强度与β-折叠量成正比,从而可以得知淀粉样纤维的生成情况,其生长曲线呈“S”型,表明溶菌酶纤维化是一个具有成核→原纤维形成→纤维延长→纤维成熟的动力学过程。2.种子对溶菌酶淀粉样纤维化的作用取成熟溶菌酶纤维,用考马斯亮蓝光度法测定种子的浓度后,再进行超声处理得到种子。将种子按新配制溶菌酶浓度的3%混合,然后进行孵育。ThT荧光实验数据表明：种子对溶菌酶淀粉样纤维生长有显著的促进作用。3.在简单多酚存在的条件下形成的种子对溶菌酶淀粉样纤维化的作用简单多酚化合物可以通过形成醌式中间体抑制溶菌酶的淀粉样纤维化。将在苯醌、邻苯二酚、对苯二酚和苯酚存在的条件下形成的成熟溶菌酶纤维作为种子,加入到溶菌酶溶液中进行孵育,实验结果表明：在简单酚类化合物作用下生成的聚集体种子对溶菌酶纤维化也表现出明显的促进作用,但整体比纯溶菌酶种子的促进作用弱,且在苯酚、邻苯二酚、对苯醌和对苯二酚存在条件下形成的种子的促进作用呈递减趋势。4.其他抑制剂对溶菌酶淀粉样纤维化的作用分别将不同浓度的DTT(二硫苏糖醇,Dithiothreitol)、PEG (2000)(聚乙二醇,Poly (ethylene glycol))、硫酸钠Na2SO4、EGC(表没食子酸,epigallocatechin)和ECG(表儿茶酚-3-五倍子酸酯,epicatechin gallate)加到溶菌酶的溶液中,孵育后进行ThT荧光检测。结果表明：DTT、PEG (2000)、Na2SO4、EGC和ECG五种物质对溶菌酶的纤维化均表现出抑制作用,其中DTT. PEG. EGC和ECG对溶菌酶纤维化的抑制作用较强,且抑制强度与其浓度呈正相关。Na2SO4对溶菌酶的抑制作用与其浓度无规律性。5.种子在上述抑制剂存在时对溶菌酶淀粉样纤维化的作用分别向含DTT、PEG、Na2SO4、EGC和ECG的溶菌酶溶液中加入种子,孵育后进行ThT荧光检测。结果表明：加种子后,DTT、EGC和ECG整体仍表现为抑制作用,但低浓度时的抑制作用较弱。向PEG浓度较小的溶菌酶中加入种子可促进溶菌酶的纤维化,向PEG浓度较大的溶菌酶中加入种子,则仍表现为抑制作用；当向含Na2SO4的溶菌酶中加入种子则均表现为种子对溶菌酶纤维化的促进作用。6.不同天数加入DTT (0.1mM/L)和种子对溶菌酶淀粉样纤维化的作用分别向两组孵育了不同天数的溶菌酶中加入种子、DTT；向孵育了不同天数含DTT的溶菌酶中加入种子；孵育了不同天数含种子的溶菌酶中加入DTT,15d后进行荧光检测。结果表明：向孵育不同天数的溶菌酶中加入种子,种子对溶菌酶纤维化的促进作用几乎不受种子加入时间的影响。而向孵育不同天数的溶菌酶中加入DTT, DTT表现出的抑制作用随其加入时间的延迟而减弱。向孵育不同天数含DTT的溶菌酶中加入种子,种子的促进作用随其加入时间的延迟而减弱,整体表现为DTT的抑制作用。向孵育不同天数含种子的溶菌酶中加入DTT,溶菌酶孵育的前6d表现为种子的促进作用,6d之后表现为DTT微弱的抑制作用。7.溶菌酶纤维对红细胞的溶血和聚集作用采用人体红细胞作为体外模型,将成熟溶菌酶淀粉样纤维与红细胞作用,通过观察红细胞的溶血和聚集情况来检测纤维的细胞毒性。结果表明：纯溶菌酶纤维的细胞毒性最强,种子和DTT有降低细胞毒性的作用。8.种子对溶菌酶淀粉样纤维化促进作用的电泳分析首先通过Native-PAGE检测,发现种子可以加快溶菌酶纤维成核和原纤维的形成,而种子在含DTT (1.0mM/L)的溶菌酶中整体表现出DTT对纤维生成的抑制作用。在Tricine体系SDS-PAGE电泳、电转和NBT(氯化硝基四氮唑蓝,nitroblue tetrazolium)实验中,发现EGC和ECG之所以可以抑制溶菌酶淀粉样纤维化,是因为它们可以形成醌类中间体并与纤维或蛋白结合形成共价修饰产物,从而破坏淀粉样蛋白的结构,进而对纤维化过程产生抑制作用；若在其中加入种子,则可能会影响共价修饰产物的生成量,从而减弱抑制效果。说明：种子对溶菌酶纤维化有促进作用,但在强抑制剂(EGC、ECG)存在时,其促进作用表现的较弱,整体表现出抑制剂的抑制作用。9.对溶菌酶淀粉样纤维形貌的测定将孵育5d的不同纤维在透射电子显微镜下观察,发现孵育5d的纯溶菌酶纤维形态短小且稀疏,含DTT的溶菌酶纤维几乎观察不到,视眼中只有几个斑点状物质存在,而含种子及DTT的纤维较长且相对密集。说明：当种子与抑制剂共存时,在溶菌酶孵育前期,种子的促进作用仍起主导作用。结论：溶菌酶在一定的实验条件下可以形成淀粉样纤维,种子对淀粉样纤维的形成有很显著的促进作用,且其促进作用整体上几乎不受种子加入时间的影响。DTT、PEG、Na2SO4、EGC、ECG对溶菌酶的生长均有抑制作用,种子和抑制剂共存时,种子表现出的促进作用,在纤维成核和原纤维形成阶段(0-5d)最为突出,且几乎不受抑制剂的干扰。说明：与抑制剂共存时,种子在溶菌酶孵育前5d的促进作用仍起主导作用。