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植物核糖体失活蛋白(ribosomal inactivating protein,RIPs)是一组来源于植物的糖苷酶，其RNA N-糖苷酶活性能使真核细胞核糖体28S rRNA第4323位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而无法与延长因子2结合并导致60S亚基失活，进而使蛋白质的合成受到不可逆的抑制。根据其亚单位组成的不同可以将其分为Ⅰ型和Ⅱ型核糖体失活蛋白，近年来，陆续有研究指出，Ⅰ型RIP具有抗肿瘤活性，其抗肿瘤功能在很大程度上依赖于其介导的细胞凋亡的发生。来自于不同学者的研究指出，用某些Ⅰ型RIP体外处理肿瘤细胞后可以观察到多聚核小体的形成、DNA片段化等特征性改变，证实Ⅰ型RIP确实可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。但是其诱导细胞凋亡的具体分子机制仍不十分清楚，限制了人们对其抗肿瘤功能的进一步认识。鉴于RIPs广泛地存在于多种植物中，大量的研究都试图尝试从植物的不同部位提取出高纯度的RIPs，目前应用得较为广泛的方法是通过盐析法先粗提出含有目的蛋白的粗蛋白，然后利用大部分RIPs都是碱性蛋白这一特点，用弱阳离子交换层析将粗蛋白提取物中的碱性蛋白洗脱，再根据洗脱蛋白分子量的不同利用凝胶层析进一步纯化，最后还要脱盐后才能得到目的蛋白。利用这种方法纯化RIPs时，一方面步骤较为烦琐，成本也比较高昂，另一方面，由于弱阳离子交换层析不能针对目的蛋白的特异性基团进行纯化，因而纯化效果受到了一定的限制，并且利用这种方法最后的产率并不高，使得这一方法很难得到推广应用。针对上述问题，结合国内外研究进展，本研究用苦瓜种子作为Ⅰ型RIP的供体，根据Ⅰ型RIP含有核苷酸结合域这一特点，利用可以与这类蛋白发生特异性结合的三榛类染料Cibacron blue F3GA制成的Blue Sepharose<WP=8>CL-6B亲和层析柱进行假配基亲和层析，再用凝胶层析法进一步纯化，通过结合使用以上两种不同的纯化方法提取、纯化苦瓜RIP。用纯化得到的苦瓜RIP处理体外培养的HL-60白血病细胞株，进而运用流式细胞仪检测、原位凋亡检测等方法观察苦瓜RIP能否诱导HL-60细胞发生凋亡。同时，利用RT-PCR、Western blot等方法深入研究了与凋亡密切相关的caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA和蛋白表达变化的情况以初步探讨苦瓜RIP诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。结果显示：1．运用硫酸铵分级沉淀、Blue Sepharose CL-6B假配基亲和层析、Sephadex-G75凝胶层析等方法提取、纯化得到了高纯度的苦瓜RIP，并且本方法提取效率较高，所获得的RIP在SDS-PAGE上呈现为单一条带。2．用40(g/ml作用浓度的苦瓜RIP处理HL-60白血病细胞株后，流式细胞仪检测结果显示处理组细胞有明显的亚G1峰出现，原位凋亡检测结果也证实了在此作用浓度下苦瓜RIP可以诱导HL-60细胞发生凋亡。3．RT-PCR结果显示，与对照组细胞相比，处理组细胞caspase-3、Bax的mRNA表达明显升高，而Bcl-2 mRNA表达变化并不明显。Western blot结果显示，经苦瓜RIP处理的HL-60细胞其caspase-3活性亚单位和Bax蛋白的表达明显升高，而Bcl-2蛋白表达则有所下降。推测在苦瓜RIP诱导的HL-60细胞的凋亡过程中，caspase-3表达及活性的升高发挥了至关重要的作用，Bcl-2和Bax则可能通过其表达量的变化对细胞凋亡进行调控。