鸭疫里默氏杆菌的生物学特性研究及外膜蛋白A基因的克隆和表达

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鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(RA)引起的感染家鸭、火鸡和多种鸟类的一种接触性传染病。该病呈急性或慢性败血症,其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。该病分布范围广,发病率、死亡率高,感染鸭消瘦、淘汰率高,给养鸭业造成了巨大的经济损失。 本研究对广东地区分离的20株RA的生物学特性进行了测定。结果表明,20株菌的形态学特性、培养特性和生化特性基本一致,符合RA的基本特征。对分离菌进行20种常用抗菌药物的药敏试验,结果这些菌株对阿莫西林、头孢类药物和庆大霉素、四环素、恩诺沙星敏感性较高。取8株菌人工感染13日龄雏鸭进行致病性试验,结果显示,试验鸭的死亡率为12.5%~100%,其中6株菌的致病力都很强。血清学特性研究表明分离菌中血清1型的阳性率为85%,推测广东地区RA的流行血清型为1型。 利用已登录的1~19型RA、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的16SrRNA基因序列,设计了一对RA16SrRNA基因的特异性引物,对RA、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌进行PCR扩增,结果只有RA扩增出672bp的目的条带;分别将RA基因组DNA和菌液进行梯度稀释,并进行PCR扩增,结果基因组DNA的最小检出量为16.5fg/μL,菌液的最小检出量为1.35×105 CFU/mL;应用建立的PCR方法对分离鉴定的20株RA进行检测,结果均扩增出672bp的目的条带,与常规方法的检测结果完全相符。说明该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于RA的快速诊断。 本研究根据GenBank上已发表的RA的OmpA基因序列,设计了一对引物,应用PCR技术扩增了6株RA分离株的OmpA基因序列。经过克隆测序后进行序列比较,结果表明6株菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码由387个氨基酸组成的蛋白质。分离菌株的核苷酸序列相似性为99.4%~99.8%,充分说明OmpA基因的种内保守性。由进化树分析结果推测不同RA的OmpA基因之间的同源性与其分离时间、血清型和毒力并无太大关系。 将扩增的1型RA的OmpA基因克隆至pET—32a(+)表达载体,鉴定正确后转化表达菌BL21(DE3),经SDS-PAGE分析,在IPTG的诱导下融合蛋白得到了高效表达;Western—blotting检测结果表明OmpA能与RA多抗呈阳性反应,具有免疫原性。将蛋白与佐剂乳化后免疫鸭,并以纯化的蛋白作为包被抗原初步建立间接ELISA方法来检测免疫鸭的抗体水平,免疫试验结果表明重组蛋白能刺激抗体产生,但却不能对同源菌的攻击提供保护。
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