论文部分内容阅读
革兰氏阴性细菌外膜（Outer membrane，简称OM）的外小页主要由脂多糖（Lipopolysaccharide，简称LPS）分子组成。这一屏障可以有效地阻止有毒物质（如抗生素等）进入细菌。因此，脂多糖对绝大多数革兰氏阴性细菌的存活是必需的。脂多糖又称内毒素，可以引起人体严重的天然免疫反应和炎症。美国科学家Bruce Beutler等因发现人体细胞膜上的Toll-样受体4(Toll-likereceptor4，简称TLR4)为脂多糖受体而荣获2011年诺贝尔生理与医学奖。 在革兰氏阴性细菌中，脂多糖在胞内合成以后，在七个脂多糖转运蛋白(Lipopolysaccharide transport proteins A-G，简称LptA-G)的参与下，从内膜经周质空间转运并组装到细菌的外膜上。在这七个脂多糖转运蛋白中，LptD/E复合体负责把脂多糖转运并装配到外膜的外小页。为理解细菌脂多糖的转运与组装机理，我们采用X-射线衍射晶体学，对LptD/E复合体从原子水平进行了深入的结构研究。为获得足够量的重组蛋白，我们尝试克隆了13种革兰氏阴性细菌的lptD和lptE基因到pBAD22载体进行共表达。发现致病菌福氏志贺菌来源的SfLptD/E复合体可以在在大肠杆菌主要外膜蛋白敲除的菌株Omp8(DE3)中可获得相对较高的表达量。为进一步晶体筛选打下了基础。通过筛选结晶条件，不同去污剂和反复晶体优化，我们得到了高分辨率的SfLptD/E复合体晶体，并且成功地用单波长反常散射方法(Single-wavelength Anomalous Dispersion，简称SAD)解析了分子量约为110，000道尔顿的LptD/E膜蛋白复合体全长2.4(A)的高分辨率晶体结构。 SfLptD/E复合体的晶体结构揭示了一个全新的桶和塞子模式的结构模型:SfLptE作为塞子堵在SfLptD C-端所形成的一个由26条β-链所围成的一个β桶里边。该β桶是迄今所见到的由单条多肽链所形成的跨膜β链数目最多、孔径最大的单体β桶状膜蛋白。在SfLptD/E复合体晶体结构中我们发现SfLptD中的Cys31和Cys724、Cys173和Cys725分别形成两对二硫键，是迄今所见到唯一含有两对非连续二硫键的外膜蛋白。SfLptD的β1和β2分别含有的Pro231和Pro246氨基酸残基，因此，破坏了这两条链之间以及和其各自相邻的β链的规则β片层(β sheet)的形成，从而在桶壁上就形成了一个潜在的脂多糖出口。这个出口位于β3和β26之间，可以允许脂多糖侧向跨越SfLptD桶壁进入外膜。组成β1和β2链氨基酸Cα原子的平均B-因子(36.8(A)2)远高于其他β链Cα平均B-因子(21.0(A)2)，显示β1和β2链在膜上柔性很强。此外，脂多糖出口区域有Tyr235、Phe241、Tyr244和Phe754等四个芳香族氨基酸，这四个氨基酸的侧链都有两种构象。这些证据都支持SfLptD桶壁上的脂多糖的出口的存在和脂多糖侧向融合插膜假说。 目前，已有研究发现，一类新研发的环状多肽药物可通过抑制细菌外膜的生成有效地、特异性地杀死耐药的绿脓杆菌。而该环肽类药物的作用靶点被认为是LptD。我们解析的SfLptD/E复合体的晶体结构为进一步研究该药物的作用机理，以及优化该药物，研发新型的抗生素打下坚实的基础。