论文部分内容阅读
目前，结核病仍是全世界最为致命的传染病，尤其耐多药肺结核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是全球结核病控制的关键性难题。缺乏有效的早期诊断方法，以及治疗周期长、副作用大，病人不易耐受等不足，使MDR-TB疫情得不到有效控制。中医治疗MDR-TB具有较好的减毒增效作用。然而，对MDR-TB中医证候的分型和诊断缺乏客观生物学依据，导致中医治疗MDR-TB疗效的优势不能稳定发挥。在本论文的第一部分研究中，我们使用微阵列、生物信息学分析和实时定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)的方法，研究MDR-TB患者、药物敏感性肺结核病(drug-sensitive tuberculosis，DS-TB)患者和健康对照(health control，HC)者血浆中差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)，以及IncRNA对MDR-TB的潜在诊断价值。在第二部分中，采用iTRAQ-2DLC-MS/MS(isobaric tags for relative and absolute quantification-coupled twodimensional liquids chromatography-tandem mass spectrometry)结合生物信息学分析方法，对MDR-TB不同中医证候患者血清进行蛋白质筛选、鉴定，生物学功能分析，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)验证分析，并运用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评估差异蛋白的诊断效果。第一部分研究发现，相比DS-TB组，有543个IncRNA(195个mRNA)在MDR-TB组中差异表达，其中181个(63个mRNA)上调，362个下调(132个mRNA)；相比HC组，有699个IncRNA(231个mRNA)在MDR-TB组中差异表达，包括345个(123个mRNA)上调，354个下调(108个mRNA)。基因本体论(Gene ontology，GO)，京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，以及编码一非编码共表达(coding-noncoding co-expression，CNC)分析表明，MDR-TB组中差异IncRNA的功能主要富集在物质代谢、炎症免疫和蛋白修饰等方面，例如脂肪酸降解通路、赖氨酸降解通路。RT-qPCR验证发现3条IncRNA在MDR-TB组中上调，包括NR110750(P=0.036)、uc.212-(P=0.011)和NR131237(P=0.008)。第二部分研究发现，71个蛋白质在MDR-TB三证中差异性表达。β转化生长因子诱导蛋白(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3，TGFBI)在肺阴虚(pulmonary Yin deficiency,PYD)证组中低表达(P=0.002)；枯草杆菌前蛋白转化酶(Pro-protein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)在阴虚火旺(Hyperactivity of Fire due to Yin deficiency,HFYD)证组中高表达(P＜0.0001);趋化因子14(C-C motif chemokine 14，CCL14)在气阴两虚(deficiency of Qi and Yin，DQY)证组中低表达(P=0.004)。因此，血清蛋白质TGFBI、PCSK9和CCL14分别是MDR-TB肺阴虚证、阴虚火旺证和气阴两虚证新的潜在蛋白标志物。第一部分研究揭示了血浆IncRNAs作为MDR-TB生物标志物的潜在诊断价值，以及这些差异表达的IncRNA在MDR-TB发病机制中的潜在机制。第二部分的研究为MDR-TB中医证候分型提供了生物学依据，对根据不同中医证候选取不同治疗方案具有重要意义。