论文部分内容阅读
尿苷作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值,已广泛应用于医药行业。微生物发酵法生产尿苷具有条件温和,操作简单,易操作等优点,但在国内尚没有实现工业化生产。本课题组之前的研究通过常压室温等离子(ARTP)诱变结合高通量筛选(HTS)的方法选育一株尿苷产量较高的菌株,将该菌株命名为B.subtilisF126。本文以F126菌株为出发菌株,通过基因工程的方法进一步提升其尿苷生产能力。在F126菌株中过表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)合成酶编码基因prs,构建F126-1菌株。摇瓶发酵结果显示,F126和F126-1菌株的尿苷产量分别为5.72 g/L和8.76 g/L。5 L罐发酵结果显示,F126和F126-1菌株分别积累尿苷20.16g/L和24.52 g/L,同时分别积累了58.62 g/L和56.62 g/L的副产物乙偶姻。为了减少副产物乙偶姻的积累,在F126-1菌株中分别敲除乙偶姻合成代谢中的alsS和alsD基因。摇瓶发酵结果显示,F126-1△alsS和F126-1△alsD菌株分别积累尿苷0.48 g/L和 6.43 g/L。F126-1△alsD菌株在 5 L 发酵罐上积累尿苷 18.32 g/L,比 F126-1降低了 25.29%,积累乙偶姻18.56 g/L,下降了 67.22%。因此,直接阻断乙偶姻的合成不利于尿苷的积累。为了弱化丙酮酸的支路代谢,在F126-1菌株中过表达丙酮酸羧化酶基因pycA,F126-1△nprE:pycA菌株在摇瓶上能积累8.03g/L的尿苷;该菌株在5 L发酵罐上积累尿苷18.38 g/L,比F126-1下降了 25.04%,积累乙偶姻45.85 g/L,下降了 18.53%,pycA基因的过表达也能减少乙偶姻的积累,但不利于尿苷的合成。以F126-1为出发菌株,分别敲除udk和argF基因,构建了 F126-1△udk和F126-1△argF菌株。摇瓶发酵结果显示,F126-1△udk和F126-1△argF菌株分别积累尿苷9.07 g/L和12.46g/L,比F126-1分别提高了 3.54%和42.24%。5 L罐发酵结果显示,F126-1△udk和F126-1 △argF菌株分别积累尿苷23.68 g/L和28.55 g/L,前者尿苷产量与F126-1相比没有明显变化,后者提高了 16.45%。同时分别积累乙偶姻52.56 g/L和51.91 g/L,与F126-1分别下降了 7.11%和7.73%;综上所看,argF基因的缺失有利于尿苷产量的提高和副产物乙偶姻的减少。