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脑出血（ICH）具有很高的死亡率和致残率，是严重威胁人类健康的重大疾病。在临床实践中，ICH灶周组织损伤及保护机制的研究是目前脑出血领域研究的热点。近年来的研究认为，铁离子和凝血酶是导致ICH后血肿周边组织损伤的2个主要因素，其神经毒性可以导致血脑屏障的破坏和脑水肿的发生，并可导致细胞死亡。我们实验室前期研究发现，自噬（autophagy）与大鼠实验性ICH灶周组织的损伤及保护密切相关。实验大鼠ICH后自噬可被显著激活，而血肿释放的过量铁离子和凝血酶则是诱发自噬的重要原因。众所周知，自噬是清除细胞内多余的蛋白和细胞器，维持细胞的代谢平衡的一种重要途径，泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬同为细胞内蛋白降解的主要途径，在机体中发挥的作用相似而又互补。在病理条件下，UPS损伤后细胞内堆积大量多聚泛素化蛋白，其蛋白清除功能可被自噬作用代偿，Sequestosome1（p62/SQSTM1或p62）正是连接两大蛋白清除途径的重要通路蛋白。然而，仍有很多问题亟待解决，如ICH是否会引起UPS功能损伤；其功能是否可被自噬所代偿；铁离子和凝血酶在此过程中又扮演什么角色；最终，自噬在ICH的神经系统损害和功能恢复中到底起了保护作用还是损伤作用等等。本课题正是基于探求上述问题的答案而进行的。本研究应用大鼠实验性脑出血模型，探讨了脑出血后灶周组织损伤与自噬和UPS之间的关系，以及铁离子和凝血酶在此过程中所扮演的角色；并通过离体实验，应用大鼠原代神经元，进一步验证ICH后自噬的作用及其代偿地清除细胞内多聚泛素化蛋白的通路。有助于更深层地去了解脑出血后灶周组织如何应对血肿的毒害作用，以期发现新的治疗靶点和策略。实验共分为3个部分：第一部分实验性脑出血灶周组织中p62、多聚泛素化蛋白与铁离子关系的研究目的：应用大鼠实验性脑出血模型，探讨脑出血后灶周组织损伤与自噬和UPS之间的关系，以及铁离子在此过程中所扮演的角色。材料与方法：共采用SD大鼠102只，分为3部分。第1部分：实验性脑出血组。实验大鼠基底节注射自体全血100μl；对照组为假手术组，仅将针头插入基底节停留10min。两组大鼠分别于术后1、3、7和14天处死，分别进行蛋白印迹分析、免疫组化染色和EM分析。第2部分：脑出血治疗组。首先于基底节注射自体全血100μl，治疗组于术后2小时开始腹腔注射铁螯合剂米诺环素（MC）；治疗对照组在相同时间点腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠注射液。术后3天处死大鼠，分别进行蛋白印迹分析和免疫组化染色。第3部分：铁离子损伤组。铁离子损伤组于基底节注射氯化亚铁溶液（0.5mmol/L）50μl；治疗组于基底节注射铁+MC（0.5mmol/L）50μl；对照组在相同部位注射等剂量生理盐水。术后3天处死大鼠，分别进行蛋白印迹分析和免疫组化染色。结果：①在HR-TEM下，在大鼠ICH各个时间点，尤其是3天和7天组，均在灶周观察到大量胞浆异常结构和包涵体，与自噬小体共存；②多聚泛素化蛋白和p62水平在从出血第1天开始升高，在第3、7天达到高峰，第14天下降。第3天和第7天的多聚泛素化蛋白和p62水平，与第1天和第14天相比，具有显著性差异。③实验性ICH MC治疗组3天时灶周组织多聚泛素化蛋白和p62的表达明显少于非治疗组，具有显著性差异。④在基底节注射氯化亚铁第3天，MC治疗组可明显降低氯化亚铁所致的多聚泛素化蛋白堆积和p62水平上调，结果具有显著性差异。结论：实验性脑出血可导致灶周组织多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调；铁离子超载在实验性脑出血灶周多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调中扮演重要角色；而铁螯合剂可以减轻实验性ICH灶周组织多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调，是ICH治疗的一个重要的靶点。第二部分实验性脑出血灶周组织中p62、多聚泛素化蛋白与凝血酶关系的研究目的：应用大鼠和PAR-1基因敲除小鼠，制备实验性ICH或凝血酶脑损伤模型，探讨凝血酶在脑出血后自噬激活和UPS损伤之间的关系，以及这种作用是否由PAR-1受体所介导。材料与方法：实验采用清洁级SD大鼠48只，野生型及PAR-1基因敲除（KO）小鼠各4只，共分为3部分。第1部分，凝血酶损伤组。实验大鼠基底节注射凝血酶（5U/50μl），对照组注射等量生理盐水，大鼠分别在术后1、3和7天处死，进行蛋白印迹和透射电子显微镜分析；第2部分，脑出血水蛭素治疗组。治疗组于基底节注射自体全血100μl+水蛭素5U，治疗对照组于基底节注射自体全血100μl+等量生理盐水，大鼠在术后7天处死。进行蛋白印迹分析；第3部分，PAR-1受体敲除组。野生型及PAR-1基因敲除小鼠各4只，于基底节注射凝血酶（0.5U，10μl），7天后处死，进行蛋白印迹分析。结果：①多聚泛素化蛋白和p62水平在从凝血酶损伤第1天开始升高，在第3和第7天达到高峰，与第1天相比具有显著性差异；②实验性ICH水蛭素治疗组7天时灶周组织多聚泛素化蛋白和p62的表达明显少于非治疗组，具有显著性差异；③PAR-1KO小鼠凝血酶损伤组7天时灶周组织LC-3II、多聚泛素化蛋白和p62蛋白的表达与野生型小鼠比较，具有显著性差异。结论：凝血酶在实验性脑出血灶周多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调中扮演重要角色；水蛭素可以减轻实验性ICH灶周组织多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调，是ICH治疗的一个重要的靶点；凝血酶通过PAR-1介导影响多聚泛素化蛋白堆积、p62水平上调和自噬的激活，针对受体的干预是未来ICH治疗的一个重要方向。第三部分自噬激活对凝血酶所致多泛素化蛋白堆积引起的细胞损伤保护作用的研究目的：为了明确ICH后灶周组织多聚泛素化蛋白堆积、p62上调与自噬的激活是否相关，以及自噬在ICH后的灶周组织损伤和修复中到底起了保护还是损伤作用。材料与方法：原代培养的神经元给予人凝血酶（5U/ml）处理，空白对照组给予等量生理盐水，再给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）或自噬激动剂雷帕霉素（Rapa）进行干预，24小时后，收集细胞分别行蛋白印迹分析、单丹磺酰尸胺（MDC）染色和死亡/存活细胞染色，培养液上清行乳酸脱氢酶（LDH）活性分析。结果：①凝血酶损伤组MDC阳性的自噬囊泡与空白对照组相比明显增多，有显著性差异（p<0.05），3-MA/Rapa干预组的自噬囊泡数量与单纯凝血酶损伤组相比明显减少/增多，具有显著性差异；②3-MA干预组自噬相关蛋白LC-3II和Cathepsin D的水平明显降低（p<0.05）；多聚泛素化蛋白堆积程度及p62水平反而明显升高，与单纯凝血酶损伤组相比，均呈现出显著性差异（p<0.05）。反之，Rapa干预组自噬相关蛋白LC-3II和Cathepsin D的水平明显增高（p<0.05）；多聚泛素化蛋白堆积程度及p62水平反而明显降低，与单纯凝血酶损伤组相比，均呈现出显著性差异（p<0.05）。③单纯凝血酶损伤组神经元的LDH水平显著提高，死亡细胞比例增高；3-MA干预组的神经元LDH活性和死亡细胞比例，与单纯凝血酶损伤组相比明显升高，具有显著性差异（p<0.05）；Rapa干预组的神经元LDH活性和死亡细胞比例，与单纯凝血酶损伤组相比明显降低，具有显著性差异（p<0.05）。结论：①激活自噬会显著减轻凝血酶所致神经元损伤后多聚泛素化蛋白堆积、p62水平的上调；而抑制自噬会使凝血酶所致神经元损伤后多聚泛素化蛋白堆积、p62水平上调的程度加重。②激活自噬显著缓解凝血酶所致神经元损伤；反之，抑制自噬则会进一步加重凝血酶所致的神经元损害。自噬的调节成为ICH挽救灶周组织治疗的一个重要的靶点。