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星形细胞肿瘤是颅内最为常见的原发性肿瘤之一,占所有颅内原发性肿瘤的60%以上。尽管采取了包括外科手术及放化疗在内的综合性治疗措施,星形细胞瘤的预后仍然很差,胶质母细胞瘤的平均生存时间仍不足一年。越来越多的证据表明,癌症是一种干细胞疾病。癌症干细胞,或称为干细胞样肿瘤细胞,是肿瘤组织中的一小群具有无限自我更新能力、多向分化潜能的特殊细胞群体。癌症干细胞具有重要的生物学及治疗学意义,它们被认为是肿瘤发生、演进及复发的细胞源泉。恶性胶质瘤是最早被证实存在癌症干细胞的实体肿瘤之一,我们课题组前期亦从脑胶质瘤新鲜组织及已建立的胶质瘤细胞系,如U87及U251细胞中分离得到胶质瘤干细胞并在体外成功培养和鉴定。癌症干细胞,如同其相对应的成体干细胞一样,也需要某种特定的微环境,即niche,以维持其自我更新能力,保持未分化状态。缺氧是包括恶性胶质瘤在内的实体肿瘤的基本特征之一。缺氧通过激活多种信号通路,促进细胞存活、增加瘤细胞运动能力、促进肿瘤新生血管化,从而在肿瘤恶性进展中发挥重要作用。新近有证据表明,缺氧可能是构成胶质瘤干细胞微环境的关键组分之一。缺氧在体外可维持肿瘤干细胞自我更新能力,保持其处于未分化状态,但到目前关于缺氧与肿瘤干细胞关系的研究均系体外研究,尚缺乏来自临床肿瘤样本的直接证据;此外,缺氧调节肿瘤干细胞“干性”的分子机制尚缺乏研究。研究目的1.探讨缺氧标记物CA IX在恶性胶质瘤中的表达规律及表达模式,重点观测CA IX表达与肿瘤干细胞标志物表达之间的关系;2.探讨恶性胶质瘤组织中CA IX表达的临床病理学意义,评价其作为预后指标的应用价值;3.探讨缺氧对恶性胶质瘤细胞功能的影响,重点观测缺氧对细胞形态、克隆形成、干细胞标志物表达及分化的作用,以证明缺氧可诱导已分化瘤细胞去分化,获得干细胞特性;4.探讨缺氧对胶质瘤干细胞自我更新、分化及干细胞标志物表达的影响,以证明缺氧可维持或增强胶质瘤干细胞“干性”;5.初步探讨Notch信号在缺氧诱导的GSCs“干性”维持或增强中的作用。研究内容和方法1.缺氧标记物CA IX在恶性胶质瘤中的表达研究:以人恶性胶质瘤组织标本为研究材料,采用免疫激光捕获显微切割(i-LCM)、免疫组化及双标免疫荧光、激光共聚焦显微术、实时定量PCR等技术,观测CA IX在恶性胶质瘤中的表达模式,评价其临床病理学意义及与患者预后的关系,并着重探讨CA IX表达与GSCs标志物表达之间的关系。2.缺氧对恶性胶质瘤细胞“干性”调节的体外研究:以U87、U251细胞系及3例原代培养胶质瘤细胞为研究材料,建立缺氧培养模型,采用透射电镜观测瘤细胞超微结构变化;MTT法检测缺氧对生长的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;Transwell小室检测细胞迁移;克隆形成实验检测瘤细胞克隆形成能力;流式细胞术检测CD133表达;分别采用实时定量PCR和Western blot检测干细胞标志物及分化标志物mRNA和蛋白表达。3.缺氧调控胶质瘤干细胞“干性”的体外研究:运用条件培养基压力筛选的方法从上述胶质瘤细胞中分离培养干细胞样克隆球,并进行干细胞标志物鉴定;采用干细胞克隆形成实验和分化实验分别观测缺氧对GSCs自我更新及分化的影响;流式细胞术检测CD133表达;免疫荧光检测干细胞及分化标志物表达;Western blot检测干细胞标志物蛋白表达;4. Notch信号通路在缺氧诱导的GSCs“干性”调节中作用的初步研究:采用Western blot检测缺氧对GSCs Notch信号关键分子表达的影响;以Notch信号特异性抑制剂DAPT处理细胞,检测其对Notch1的抑制作用,确定合适的浓度(5μg/ml);采用干细胞克隆形成及分化实验观测DAPT对缺氧诱导的GSCs“干性”增强及分化抑制的拮抗作用。研究结果1.缺氧标记物CA IX在恶性胶质瘤中的表达及其临床病理学意义:CA IX在恶性胶质瘤中呈过度表达,多表达于高级别胶质瘤坏死灶周边及低级别胶质瘤侵袭性边沿的瘤细胞。CA IX表达与肿瘤组织学分级及大小关系密切;CA IX(++)组患者的总体生存期及无疾病进展生存期均显著低于CA IX(+)及CA IX(-)组患者(p<0.001);多因素分析显示CA IX(++)(p<0.001)为预后差的独立预测指标。2.缺氧标记物CA IX表达与干细胞、侵袭标志物表达之间的关系:双标免疫荧光检测显示CA IX阳性区域表达CD133、Oct4、Sox2及CXCR4的瘤细胞数目均分别显著高于临近的CA IX阴性区域,而CA IX的表达与p53及Ki-67无关;显微切割获得的CA IX阳性瘤细胞CA IX、Oct4、Sox2及CXCR4 mRNA水平明显高于相对应的临近CA IX阴性瘤细胞。3.缺氧对恶性胶质瘤细胞“干性”调节的体外研究:缺氧培养条件下,胶质瘤细胞呈现明显的形态学变化,总体上是从成熟变得“幼稚”,表现为细胞器减少、胶质纤维丝消失、细胞核仁的出现等;缺氧显著增强瘤细胞克隆形成能力,增加紧密型克隆形成的比例;缺氧增强瘤细胞的迁移能力;流式细胞检测显示缺氧显著提高CD133阳性细胞比例;缺氧条件下干细胞标志物mRNA及蛋白水平明显上调,而GFAP表达明显减弱;总体上缺氧对瘤细胞生长、细胞周期及凋亡的影响并不明显。4.缺氧调控胶质瘤干细胞“干性”的体外研究:采用条件培养基压力筛选成功获得胶质瘤干细胞克隆球,后者高表达干细胞标志物;缺氧培养下,GSCs克隆球形成比例及大小均明显增加,而克隆球向胶质细胞的分化明显受抑;缺氧培养使得GSCs CD133阳性细胞比例明显增高,干细胞标记物Oct-4及Sox-2蛋白表达上调。5. Notch信号通路在缺氧诱导的GSCs“干性”调节中的作用:缺氧处理后GSCs Notch信号关键分子(Notch1,Notch1 ICD,Hes-1)蛋白表达明显上调;以DAPT处理后,GSCs Notch1蛋白水平显著下降,呈现梯度依赖性,5ug/ml DAPT对Notch1蛋白表达的抑制率达80%;以5ug/ml DAPT处理各组GSCs,可显著抑制缺氧对GSCs克隆形成增强的诱导作用,降低克隆形成数目,形成的克隆体积也明显缩小。同时可部分抵消缺氧诱导的GSCs分化抑制作用。结论1.缺氧标志物CA IX在恶性胶质瘤过度表达,其高表达意味着较高的组织学分级及预后不良,CA IX介导的肿瘤恶性进展可能与瘤细胞“干性”增强及侵袭力的增加有关;2.我们首次证实了在恶性胶质瘤组织中CA IX阳性区域存在更多干细胞样表型的瘤细胞,而且切割的CA IX(+)瘤细胞干细胞相关的基因mRNA表达水平显著高于相匹配的CA IX阴性瘤细胞。该结果为缺氧是肿瘤干细胞niche的假说提供了基于临床样本的强有力证据;3.缺氧可诱导已分化胶质瘤细胞去分化,获得干细胞特性;4.缺氧可诱导胶质瘤干细胞“干性”维持或增强,抑制其分化;5. Notch信号在缺氧诱导的GSCs“干性”维持或增强中起着关键性作用。