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小鼠单克隆抗体技术已成为生物医药领域不可或缺的研究工具，在疾病的诊断和治疗领域也得到广泛应用。然而，由于小鼠自身免疫系统的局限，某些抗原或表位，特别是同为哺乳动物的人体抗原在小鼠体内可能因为种属相近而不易产生好的免疫应答，给制备相应的小鼠单克隆抗体造成一定的困难。因此，有必要基于其它种属动物开发新的抗体制备技术。禽源抗体技术也称卵黄抗体技术（简称IgY技术），是用免疫原刺激禽类动物，产生相应的特异性抗体，该抗体会转运、储存在卵黄中，经特殊的提取技术，可从卵黄中获得大量特异性的多克隆抗体的一种抗体制备技术。相较于哺乳动物的IgG抗体，禽源IgY抗体的优点有:1)减少对动物的伤害，符合日渐严格的动物伦理要求;2）饲养成本低，抗体产量高;3）缺少与风湿因子反应的Fc结合位点，不会与血清中的C-反应蛋白发生交叉反应，有助于提高血清检测的特异性;4）不能激活哺乳动物的补体系统，有助于降低补体活性检测中的干扰现象;5）不能结合细菌及哺乳动物细胞表面Fc受体，可应用于双重免疫组化检测;6）与哺乳动物种属系统发生距离较远，有助于制备哺乳类抗原的免疫血清等。本论文的目的是，通过摸索各实验环节的实验参数及条件，在实验室内建立起一个有效的禽源多克隆抗体制备技术平台，并应用该禽源抗体技术制备HIV病毒衣壳蛋白(P24)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的特异性IgY多克隆抗体，并比较评估禽源IgY多克隆抗体在HIV免疫诊断试剂及NSE免疫诊断试剂研发应用的潜能。 首先，通过文献查阅并结合实际条件，选取海兰褐蛋鸡作为实验动物，并进一步摸索实验鸡的饲养条件、免疫方式、禽蛋收集、抗体制备、抗体保藏等条件参数，初步建立禽源多克隆抗体制备技术平台。结果如下:(1)实验鸡的饲养:实验室条件下，笼养海兰褐蛋鸡是比较合适的，其次要注意不同生长期海兰褐蛋鸡对适宜的温度、湿度、光照、营养等方面的需求，尤其重要的是在海兰褐生长后期需要大量储备钙质以保证产蛋期的产蛋质量;实验室饲养条件下，海兰褐蛋鸡开始产蛋的日龄是154天，与养鸡场中饲养的蛋鸡保持一致;且在产蛋高峰期，实验室条件下饲养的海兰褐蛋鸡的周产蛋率能够达到95％;(2)实验鸡的免疫:选用弗氏佐剂，以500ug/只的剂量，皮下与肌肉混合多点免疫，间隔周期14天的免疫方案;通过该免疫方案，能够获得滴度在105以上的免疫血清;(3)禽蛋的收集:将不同时期产下的含有特异性抗体的鸡蛋标记后保藏在4℃条件下;(5)鸡源IgY抗体的纯化:通过多种纯化方法的比较，最终确定以PEG6000梯度纯化来获得纯度较高、活性较好的抗体;用PEG6000梯度沉淀纯化方法进行IgY抗体制备，平均每个卵黄可以获得约50 mg的抗体;(5)抗体稳定性分析:根据抗体活性变化确定IgY抗体的热稳定性、酸碱稳定性等;实验结果表明，温度低于70℃的条件下，IgY抗体的活性相对稳定;当环境中的pH在4.0-11.0范围内，IgY抗体的活性还是比较稳定的;在4℃和-20℃条件下，IgY抗体能够长期保存。 P24抗原检测是HIV早期辅助诊断的方法，它要求检测具有高灵敏度（可以检测到Pg级别的抗原）、低漏检率（对全部亚型的P24抗原均可以有效检出）、高特异性（减少样品带来的非特异性）。目前的诊断试剂仍无法完全满足临床检测的要求，因此我们希望应用IgY抗体技术来制备P24特异性IgY抗体，期望能够提高检测的特异性。肿瘤标志物的检测是肿瘤早期诊断的一种有效方式，而肿瘤标志物的抗体是建立肿瘤诊断试剂的关键活性原料。由于肿瘤标志物多数是人源的，与哺乳动物具有一定的亲缘性，因此在大小鼠平台制备肿瘤标志物抗体有一定的难度。所以，我们希望能够运用IgY抗体技术来制备肿瘤标志物的特异性抗体。 其次，应用禽源多克隆抗体技术平台来制备特异性的抗HIV-1衣壳蛋白(P24)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等的IgY多克隆抗体。实验结果如下:(1)用重组蛋白rP24分别免疫小鼠、大鼠、鸡和兔子等实验动物，发现四种动物均可对P24抗原产生良好的免疫反应;纯化获得抗rP24的IgY抗体（单个卵黄中获取60mg的IgY抗体），与特异性抗rP24的小鼠抗体H5F4、大鼠抗体R15A2进行抗体配对，并分析该配对与两个较佳的P24检测小鼠抗体配对H5F4-m9E8及P24大小鼠抗体配对RI5A2-m9E8检测P24抗原的性能。结果显示，IgY可与P24小鼠抗体H5F4及大鼠抗体R15A2形成较好的P24抗原检测配对，夹心法ELISA的检测下限是1ng/ml，且能够检出多数不同亚型的P24抗原，具有成为HIV诊断试剂候选抗体原料的潜能。(2)用神经元特异性烯醇化酶（NSE重组蛋白）对小鼠、大鼠、鸡等实验动物进行免疫，发现NSE在鸡体内的免疫效价比小鼠和大鼠体内的效价高10倍。同时，纯化获得的IgY抗体标记磁珠后作为捕获抗体，与标记吖啶酯的对照抗体9601作为报告抗体形成的免疫化学发光检测配对，对重组抗原rNSE具有很好检测线性(R2=0.999)，检测灵敏度是0.1-500ng/ml。但是在NSE天然抗原的检测上，IgY-9601检测配对存在检测值较低且与背景检测值线性相关性较一般(R2=0.6097)等问题，有待进一步的条件优化。 总之，本研究初步建立了制备禽源多克隆抗体技术平台，并利用该技术平台制备了抗HIV-1衣壳蛋白P24和抗神经元特异性烯醇化酶NSE的鸡多克隆抗体。在此基础上，证明了IgY抗体应用于HIV免疫诊断中的可行性;同时证明IgY抗体技术在肿瘤标志物抗原的特异性抗体的制备方面具有一定的优势，可以制备出高亲和力的肿瘤标志物抗原的特异性抗体，可以弥补小鼠单抗制备技术的不足。本研究为禽源多克隆抗体制备技术的推广和应用奠定了坚实的基础。