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脐血是除骨髓、外周血之外又一极具有潜力的造血干／祖细胞(hematopoietic stem／progenitor cells，HSPCs)来源，在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景十分广阔。国内外在细胞水平和分子水平上，对脐血造血干／祖细胞进行了大量的研究。细胞水平的研究热点之一是如何对造血干／祖细胞进行扩增，同时又尽可能使其不分化，保持干／祖细胞的性能，目前已取得了一定的成果；分子水平上的研究主要集中在基因治疗上，近几年来也取得了不少成果，已在动物模型上取得了很大的进展。但人们对脐血HSPCs本身的认识还远远不足。至今还未能明确其自我更新的机制，更未能筛选到与造血干细胞自我更新及其他特性相关的基因。同时就细胞水平而言，各实验室所采取的培养扩增方法不尽相同，使得不同实验室的数据之间可比性较差，且对于何种扩增方法是最优化的方法尚无定论。因此寻求HSPCs的最佳培养扩增条件还有待进一步的研究。 本实验从脐血中分离单个核细胞和CD34~+细胞，体外培养扩增，观察细胞形态，检测不同培养基对细胞生长的影响，测定生长曲线，寻求细胞合适的接种密度，加入外源细胞因子体外扩增培养，并利用分子生物学方法和手段，比较CD34~+和CD34~+细胞基因表达的差异，力求找出CD34~+细胞特异表达的基因，为将来的造血干／祖细胞的分子鉴定提供相应的技术。 利用密度为1.077g／ml的Ficoll分离液从人脐血中分离HSPCs，分离得到的细胞经瑞-姬染液染色，镜下观察可见明显的单个细胞核。脐血平均量为每袋80±15ml，分离得到的单个核细胞量为5.84±0.98x10~8个。将这些细胞用MACS磁性分选系统分离得到CD34~+细胞量为4.67±0.79×10~6个。CD34~+细胞的得率为0.8±0.1％。分离后的细胞在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期三个时期。经过比较，发现IMDM培养基较适合脐血HSPCs的体外培养和扩增。采用细胞因子组合为SCF(50ng／ml)、IL-3(10ng／ml)、FL(50ng／ml)、TPO(20ng／ml)、GM-CSF(10ng／ml)、IMDM完全培养液体外扩增CD34~+细胞时，7天后细胞扩增了约9.84倍，扩增后的细胞中CD34~+细胞约占5.4％，CD34~+细胞的有效扩增浙江大学硕士学位论文倍数为1.59倍:14天后细胞扩增了约15.35倍，扩增后的细胞中CD34‘细胞约占3.4%，CD34+细胞的有效扩增倍数为1.57倍。为探索造血干/祖细胞的分子鉴别技术，本研究采用差异筛选(DD一RT)PCR方法对CD34斗细胞和CD34一细胞及培养扩增前后的CD34+细胞进行差异表达分析。扩增前的CD3矿细胞和CD34-细胞差异表达分析的结果是得到一条差异带，经序列测定结果为人CD34基因的一片段;培养扩增前后的CD34‘细胞差异表达分析的结果是没有得到差异带。该结果表明用差异筛选(DD一RT)PCR方法可以从分子水平上对造血干/祖细胞进行鉴别。