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在本论文中，我们利用液相核磁共振技术解析了两个具有重要生物学功能的蛋白质与其配体的复合物溶液三维结构并研究了其相互作用机制。论文包括两个部分：第一部分主要研究了核蛋白UHR目的PHD结构域与组蛋白H3 N-端多肽的识别机制；第二部分研究了ESCRT-Ⅲ体系中Vtal蛋白N-端结构域与Did2肽段(176-204aa)的相互作用。
在论文第一部分中，第一章综述了UHRF1蛋白与表观遗传修饰的联系及其三维结构的研究现状。第二章中，首先利用核磁共振技术初步考察了PHDUHRF1与H3K9me0和H3K9me3两种多肽相互作用，研究结果表明PHDUHRF1与两种多肽的结合模式可能是一样的，这说明PHDUHRF1并不像之前报道的那样特异性地识别H3K9me3。为此，我们分别解析了自由态PHDUHRF1以及PHDUHRF1/H3K9me3和PHDUHRF1/H3K9me0两种复合物的三维溶液结构。第三章中，自由态PHDUHR目的溶液三维结构表明其C-端包括一个经典的PHD结构域即两个交叉的锌指结构域，其N-端的一个loop区与锌离子配位形成非经典的锌指结构域。复合态PHDUHRF1与自由态PHDUHR目的溶液三维结构对比发现，结合两种H3多肽前后PHDUHR目的整体构象变化不大。PHDUHRF1/H3K9me3及PHDUHRF1/H3K9me0复合物溶液结构分析表明，PHDUHRF1通过识别未修饰的H3R2介导与H3 N-端尾部相互作用。接下来，我们利用核磁滴定实验和荧光实验对这种识别模式的特异性进行验证。结果表明，H3R2的双甲基化使PHDUHRF1结合H3多肽的能力降低十多倍，而H3K4及H3K9甲基化则基本不影响PHDUHRF1对H3多肽的结合。另外，将H3R2或PHDUHRF1中与R2相互作用的关键残基D347、D350进行突变，发现当R2或D347突变为A(丙氨酸)后，几乎完全破坏了PHDUHRF1与未修饰的H3多肽的结合；D350突变为A之后，PHDUHRF1与未修饰的H3多肽结合能力也有明显下降。结合复合物三维结构及以上生化数据，我们可以确定PHDUHRF1主要通过D347和D350特异性识别未甲基化修饰的H3R2来结合H3 N-端尾部肽段。最后，蔗糖密度梯度实验表明，PHDUHRF1在核小体水平上，不能引起染色质形态变化。总之，我们的研究表明PHD UHRF1主要通过两个保守的天门冬氨酸(D347和D350)形成的氢键网络来特异性识别未修饰的H3R2。目前，对特异性识别组蛋白R2修饰状态的效应蛋白的研究还不多，而本部分工作为特异性识别不同修饰R2的效应蛋白增添了一员。论文第二部分研究了ESCRT-Ⅲ体系中Vtal蛋白的N-端结构域与Did2肽段(176-204aa)复合物溶液结构及相互作用。第一章综述了多囊泡体(MVB)途径中ESCRT体系的研究现状，以及催化ESCRT复合物解体的过程中相关蛋白Vps4及其调控因子Vtal、Did2等结构和功能研究现状。第二章中我们解析了VtalNTD/Did2(176-204)复合物溶液三维结构。首先构建了pSMT3 wDid2(176-204)表达质粒，并表达、纯化得到了纯度很高的VtalNTD蛋白和wDid2(176-204)多肽。制备了三种复合物样品包括13C，15N双标记VtalNTD/非标记的Did2(176-204)复合物样品，I3C，15N，70%2H三标标记的VtalNTD/非标记的Did2(176-204)复合物样品以及13C，15N双标记wDid2(176-204)/非标记的VtalNTD复合物样品，并在配有低温探头的800M核磁谱仪上采集了一系列二维和三维实验，用于结合态的单个蛋白组分NMR信号归属和分子间NOE信号归属。最终用XPLOR-NIH程序计算得到VtalNTD/Did2(176-204)复合物溶液结构。在第三章中，首先分析了结合Did2(176-204)肽段前后VtalNTD的主链原子1HN、15N的化学位移扰动，确定了VtalNTD蛋白上Did2(176-204)肽段的结合界面为VtalNTD的第一个MIT结构域。通过核磁滴定实验，分析了结合VtalNTD蛋白时Did2(176-204)肽段的1H-15NHSQC谱图变化，确定Did2(176-204)主要利用MIM1(E190-G204)区域与VtalNTD作用。然后考察了VtalNTD/Did2(176-204)复合物的结构特征。结合态VtalNTD的整体折叠与自由态VtalNTD的晶体结构比较类似，第一组反平行螺旋α1-3组成了MIT1结构域，另一组反平行螺旋α5-7组成了MIT2结构域，α4和一段无规结构串联了两个MIT结构域。结合态Did2(176-204)肽段的MIM1区域形成α螺旋，结合在由VtalNTD的MIT1结构域的α2和α3形成的、高度保守的沟槽中。进一步结构分析表明，VtalNTD/Did2(176-204)肽段的结合模式与Vps4-MIT结合CHMP1A-MIM1的模式非常相似，属于第一种经典的MIT识别配体模式即MIT-MIM1模式，表明Did2的MIM1结构域不能同时与Vps4和Vtal结合。这为理解Vps4-Vtal复合物催化ESCRT-Ⅲ复合物解体的过程中，Did2所发挥的功能提供了结构生物学基础。