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植物生物质是非常丰富的可再生资源,利用纤维素酶将生物质降解为葡萄糖对于生物燃料的生产具有巨大潜力,而纤维素酶的低水解效率以及较高的成本是生物燃料生产的关键障碍。近年来,在细菌和真菌中发现的一类新的纤维素降解酶——铜离子依赖的多糖单加氧酶（Polysaccharide Monooxygenases,PMOs）,因其氧化降解纤维素的作用而备受关注。本研究从嗜热毛壳菌中的AA9家族（Auxiliary Activity family 9）PMO酶为研究对象,利用薄层层析法（TLC）、基质辅助激光解析电离飞行质谱（MALDI-TOF-MS）、高效液相离子色谱（HPAEC-PAD）、碘氧化、硼氢化钠还原、溴氧化以及定点突变等方法,对其区域选择性进行了深入的研究。本文从嗜热毛壳菌中获得了完整连续的目的基因Ctpmo1,并异源表达获得CtPMO1纯酶,该酶表达正确,其自然N端为组氨酸,且该组氨酸没有甲基化修饰。将CtPMO1酶与不溶性底物磷酸膨胀纤维素在pH5.0、50°C条件下反应48小时,TLC分析显示随着时间增加产物含量逐渐增加,其可溶性酶解产物由纤维二糖至纤维六糖组成。MALDI-TOF-MS分析显示,酶解产物中除纤维寡糖外,还存在氧化型的寡糖。MALDI-TOF-MS/MS分析,结果显示了大量非氧化产物的碎片离子峰和C6或C4氧化产物的碎片离子峰以及仅可能在C6位存在氧化的离子,说明在CtPMO1酶可溶性酶解产物中存在C4和C6氧化产物。将CtPMO1酶可溶性酶解产物溶于DMSO-d6进行核磁共振1H谱分析,在δ8.39处出现一个醛基氢的信号,也说明产物中存在C6氧化产物。酶解产物经三氟乙酸酸水解后使用HPAEC-PAD分析确定了酶解产物中存在C1氧化产物。本文使用一种简便有效的新方法区分C4和C6氧化产物,将酶解产物用溴水氧化后进行MALDI-TOF-MS分析,检测到m/z+28和m/z+30离子峰,确定酶解产物中同时存在C4和C6氧化产物。为验证新方法的有效性,使用硼氢化钠还原酶解产物后酸水解,HPAEC-PAD分析确定了酶解产物中存在C4氧化产物。综上所述,CtPMO1酶对底物同时具有C1、C4和C6氧化的功能。内切-1,4-β-D-葡聚糖酶处理酶解反应后的不溶物（剩余的磷酸膨胀纤维素）,用新方法进行分析,结果说明CtPMO1酶的C1和C4氧化产物也存在于酶解反应不溶物中,其中仅有少量C6氧化产物存在于CtPMO1酶反应不溶物上。将CtPMO1酶与可溶性寡糖纤维五糖和纤维七糖反应,TLC分析显示CtPMO1酶对两种可溶性纤维寡糖均有降解作用,其中对纤维七糖降解作用更明显。MALDI-TOF-MS分析显示酶解产物中除还原型寡糖外,还有氧化型寡糖,即CtPMO1酶对纤维七糖也具有C1和C4/C6氧化作用;溴水氧化后MALDI-TOF-MS分析说明CtPMO1酶对纤维七糖也具有C4和C6氧化作用,证明了C6氧化更容易发生在可溶性寡糖底物上。采用定点突变的方法对CtPMO1酶底物结合平面的四个芳香族氨基酸Tyr27、His64、His157和Tyr206进行突变来研究其区域选择性,由此得到了四种不同的突变酶。TLC分析显示突变酶之间活性表现出较大差异,His64和His157对酶活影响最大,其次是Tyr206,而Tyr27对酶活无明显影响。MALDI-TOF-MS分析显示突变酶酶解产物的组成也发生了很大变化,分析结果说明His157的突变造成酶活性全部丧失,是酶活性必需的位点;His64对于CtPMO1酶的C1和C4/C6氧化作用起到关键作用;Tyr206影响整体的酶活性;而Tyr27对于产物构成无明显影响。溴水氧化后MALDI-TOF-MS分析结果证明,Tyr27并不影响CtPMO1酶的C1/C4/C6氧化活性或影响不大;His64影响CtPMO1酶C4和C6氧化活性;Tyr206影响CtPMO1酶的C6氧化活性。分析突变酶反应不溶物同样也证明上述CtPMO1酶区域选择性的结果。另外,采用定点突变的方法对除芳香族氨基酸外其它位点的残基进行初步研究:突变活性中心位点His1、His83和Tyr168后分别与底物反应,TLC分析均未检测到产物,则这三个位点对于CtPMO1酶活性起到至关重要的作用;将活性中心附近的氨基酸Gln166突变为丙氨酸后酶活丧失,突变为谷氨酸后对底物表现出了不同于野生型的切割方式,说明该位点与CtPMO1酶对底物的切割方式有关。序列比对和系统发育树结果显示,包括本文研究的CtPMO1在内的C6氧化PMO分别位于不同分支,分别与报道的三类PMO相对应。根据以上结果,我们建议把AA9家族分为C1/C6氧化PMO、C4/C6氧化PMO和C1/C4/C6氧化PMO三类。