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21世纪,能源危机、环境污染成为亟待解决的问题,纤维素作为可再生资源,既可以提供能量,又可以提供化工产品等物资,展现了广阔的应用前景。利用微生物降解等生物技术成为最有利的途径。哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）既不分泌游离的纤维素酶系,也没有纤维小体结构,却能够快速彻底的降解结晶纤维素,被称为第三种降解机制。为了研究这种新型的降解机制,本论文包括以下内容：首先,我们利用同源双交换基因敲除的方法筛选可能参与纤维素降解的基因。通过把线性DNA电转入菌体发生同源双交换,从而将目的基因失活的方法,对大量推测可能参与纤维素降解的基因进行了定点敲除,并对敲除株的生长、纤维素降解和运动能力等方面的表型进行了初步研究,以确定这些基因可能参与的生理功能。并进一步对各个基因的性质和对纤维素降解的影响进行了研究。Chu0125在NCBI中被标注为肽聚糖关联脂蛋白-Pal。其缺失后导致突变株不能降解结晶纤维素,却对RAC（再生无定型纤维素）、纤维二糖和葡萄糖的利用没有影响,说明chu0125是哈氏噬纤维菌降解结晶纤维素的关键基因。对突变株的纤维素酶活、纤维素吸附能力、软硬琼脂扩散能力和玻片表面的滑动能力的研究表明其性质与野生菌株没有明显差别,排除了与结晶纤维素降解能力缺失的关系。SEM结果显示菌体在滤纸表面的排列不如野生型菌株排列整齐,即使到生长后期菌体也比较稀疏。最后通过提取外膜蛋白进行SDS-PAGE,发现CHU0125蛋白条带清晰可辨,在突变株图谱中缺失,同时发现了另外一个蛋白条带的量在突变株中明显减少,经质谱鉴定为CHU0522,说明CHU0125的缺失影响了其它蛋白。CHU0125缺失突变株对外界环境压力（结晶紫、H202、抗生素等）较野生菌敏感程度加大,而且在有机物培养基中的生长较野生菌出现了较大缺陷,推测CHU0125参与维持外膜蛋白的完整性和物质运输。对该蛋白进行异源表达,结果得到包涵体而导致实验失败。对该基因进行分析,发现该蛋白含有三个保守的结构域：位于N端的TPR结构域,中间位置的PD40结构域,C末端位置的ompAC-like结构域,结构类似于pal或MotB蛋白,并进一步对可能与其发生相互作用的其他基因进行了初步研究,猜测哈氏噬纤维菌中Pal可能是通过影响纤维素降解产物的运输而导致突变株失去了降解结晶纤维素的能力。HtrA （Hightemperature requirement A）家族的丝氨酸蛋白酶对细菌抵抗外界压力尤其是耐高温生长中发挥了重要作用,在哈氏噬纤维菌的基因组中有两个同源蛋白的编码基因chu0052和chu3006,两者相似度（identity）高达79%。为了了解该家族蛋白酶的生理功能和对哈氏噬纤维菌降解纤维素的影响,本实验利用同源双交换基因敲除构建了三个突变株：△0052、△3006两个单基因敲除突变株和A3006-0052双基因缺失突变株。A0052和A3006-0052突变株都对高温敏感,33℃时不能生长,而在降低温度的情况下生长能力有很大程度的回复。虽然△3006在适温30℃和稍高温度下的生长与野生型菌株相当,展现了耐高温性质,却在降低温度的情况下生长速度逐渐减慢,甚至在21℃生长出现了明显的延迟。在30℃恒温条件下仅变动培养基的pH值,发现△3006突变株生长状况较野生菌株和△0052突变株发生明显的波动,暗示了CHU3006在pH压力条件下的作用。△0052和△3006-0052突变株的纤维素降解能力、纤维素比酶活和运动能力都明显下降,而△3006与野生型菌株差别不大。半定量RT-PCR结果显示两个基因有着不同的表达模式,chu3006是诱导型,而chu0052本底表达量就很高。△3006-0052双基因缺失突变株在适温（30℃）、液体条件下培养时菌体形态发生了很大的改变,有的菌体出现裂解；在高温（37℃）、固体滤纸条件下,其形态也发生了改变,出现很多环状的结构,而两个单基因缺失突变株在两种条件下都没有发现明显的变化。提取外膜蛋白进行SDS-PAGE,发现双基因缺失突变株的条带较野生型发生了很大的改变,而两个单基因敲除突变株没有显著变化,暗示了两蛋白酶功能互补性,并对差异蛋白进行了质谱鉴定。通过对chu0052和chu3006基因序列分析和功能的研究,对其在NCBI中注释进行了更正,认为两个基因在结构（氨基酸序列）上均类似于DegQ,而在功能上CHU3006更接近于DegQ,并非标注的DegP,CHU0052在热激条件下起着更为关键的作用,其功能上更接近DegP。研究表明CHU0052是高温下生长必需的蛋白酶,在高温生长条件下CHU3006对CHU0052的缺陷有一定弥补作用。研究还首次发现CHU3006与菌体在低温下的生长密切相关,并与菌体的耐酸和耐碱性相关。