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目的：(1)通过观察抗癌中药复方(CHMP)药血清及其协同顺铂对卵巢癌细胞SKOV3的形态、增殖以及凋亡的影响，试图解释CHMP在体外对当前卵巢癌化疗一线药物顺铂(DDP)的增效作用。
(2)探讨CHMP药血清、DDP对SKOV3细胞株Fas/FasL介导的免疫逃逸的逆转作用。
(3)建立裸鼠皮下卵巢癌移植瘤模型，观察CHMP协同DDP在活体的抑瘤作用。
(4)系统观察CHMP对DDP模型小鼠的造血系统和免疫功能的影响，探讨CHMP对免疫功能的调节与抗化疗骨髓抑制作用机理。
(5)从与诱导肿瘤细胞凋亡主要相关的Fas/FasL及TNFR死亡受体通路及Caspase的活化等凋亡过程中的关键步骤出发，研究CHMP、DDP体内外对SKOV3细胞凋亡相关基因的表达调控。通过以上五部分实验，试图阐述抗癌CHMP协同DDP抗卵巢癌的确切机制。
方法：(1)制备两个补益及解毒化瘀复方(即CHMP1、CHMP2)颗粒药血清：选用正常SD大鼠，分为正常对照组、CHMP1组、CHMP2组、CHMP1、CHMP2按大、中、小三个不同剂量灌胃给药，对照组给予相同剂量的生理盐水。一次给药后1h、2h、3h，二次给药后1h、2h、3h，于无菌条件下自下腔静脉采血，制备不同时相、不同剂量的CHMP1、CHMP2血清。对药血清进行分组：CHMP1血清组，临用前将CHMP1血清加入RPMI-1640培养液，浓度10％；CHMP2血清组，临用前将CHMP2血清加入RPMI-1640培养液，浓度10％；对照组，用含10％正常大鼠血清的RPMI-1640培养液配置，浓度10％；DDP组，用含10％正常大鼠血清的RPMI-1640培养液配置，DDP终浓度为2μg/ml(小剂量)、10μg/ml(中剂量)、20μg/ml(大剂量)。MTT法测定各时相及不同剂量药血清对SKOV3在24、48、72、96h细胞增殖的影响，以确定药血清最佳时相及剂量。MTT法测定两药物相互作用指数(CDI)，观察CHMP与DDP之间的协同作用。采用流式细胞技术(FCM)分析对照组、CHMP1组、CHMP2组、DDP组、CHMP1+DDP、CHMP2+DDP组药血清作用于SKOV3细胞后的细胞凋亡及细胞周期的变化，丫啶橙染色法及DNA琼脂糖凝胶电泳法观察上述各实验组细胞凋亡。
(2)制备CD3AK细胞：将外周血用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞(PBMC)，制备好的单个核细胞中加入CD3McAb(终浓度为50ng/ml)、rhIL-2(终浓度为50U/ml)，在37℃、5％CO2孵箱中培养，每2～3d换液一次，换液时补加CD3McAb及rIL-2，使CD3McAb及rIL-2终浓度与培养细胞的CD3McAb及rIL-2初始浓度相同。继续作扩增培养，4天后收集备用。使用血清药理学方法，MTT法检测对照组、CHMP1组、CHMP2组、DDP组、CHMP1+DDP组、CHMP2+DDP组CD3AK细胞对SKOV3细胞杀伤作用，流式细胞仪检测细胞表面Fas/FasL分子和各实验组SKOV3细胞对JurkatT细胞凋亡的影响。
(3)建立裸鼠人卵巢癌细胞株SKOV3皮下移殖瘤模型。通过测定对照组、CHMP1组、CHMP2组、DDP组、CHMP1+DDP、CHMP2+DDP组肿瘤体积的变化，TUNEL检测肿瘤组织凋亡以及HE染色，光镜、电镜下观察肿瘤组织病理，评价在体内中药复方颗粒协同顺铂抗卵巢癌的作用。
(4)腹腔ipDDP小鼠(BALB/C)建立免疫抑制模型，分组同上，制备脾细胞，MTT法测定NK细胞杀伤活性，流式细胞仪检测脾淋巴细胞亚群，HE染色观察脾脏组织的病理学改变，检测外周血白细胞数，计数骨髓有核细胞数。碳粒廓清法测定小鼠单核细胞的吞噬指数。
(5)Westernblot及比色法检测上述各组SKOV3细胞TNFR1、caspase-3,8蛋白表达和活性改变，半定量RT-PCR检测各实验组SKOV3细胞或瘤组织Fas/Fasl、TNFR1和A20mRNA的表达。
结果：(1)CHMP1和CHMP2均在2t-1时相药血清抑制最好，用2t-1时相的药血清培养SKOV3细胞，MTT测定各剂量组SKOV3细胞生长均表现出明显的抑制作用，药物剂量与抑制作用大小无线性关系，以中剂量抑制作用最好，DDP随剂量增加，对SKOV3细胞的抑制率增高，以高剂量DDP抑制率最好。故以后的实验均选2t-1时相、中剂量CHMP1、CHMP2血清及高剂量DDP血清。CHMP1、CHMP2与DDP联合作用，两两药物之间有协同作用；SKOV3细胞经对照组、CHMP1组、CHMP2组、DDP组、CHMP1+DDP组、CHMP2+DDP组血清作用48h后，丫啶橙染色，荧光显微镜下观察，对照组SKOV3细胞呈均匀黄绿色荧光染色，而经药血清处理的各组细胞则可见细胞核或细胞质内出现致密浓染颗粒块荧光凋亡细胞；各实验组血清作用卵巢癌细胞48h，琼脂糖电泳就显示出典型的凋亡梯度状条带；流式细胞仪检测凋亡结果显示各实验组在0～96小时范围内，随着时间延长，G0/G1期所占细胞比例逐渐增加，S及G2/M期细胞逐渐变少，说明经含药血清作用后，主要阻滞SKOV3细胞于G0/1期，联合用药组对SKOV3细胞凋亡的影响强于单独用药组。
(2)各组SKOV3细胞和JurkatT细胞共培养体系中，对照组、DDP组、CHMP1组、CHMP2组DDP+CHMP1组、DDP+CHMP2组JurkatT细胞的凋亡率，表明药血清可以显著提高CD3AK细胞对SKOV3细胞的杀伤率(P＜0.01)。
(3)病理HE染色可见，对照组瘤细胞生长旺盛，肿瘤组织大量异型细胞呈团块状分布，核分裂相多，少量坏死(+)。CHMP2组肿瘤细胞变性、坏死，细胞密度和分裂相明显降低。CHMP1+DDP组、CHMP2+DDP组肿瘤细胞数量减少，大部分细胞坏死(++～++++)，可见肿瘤细胞残影、炎细胞浸润。电镜下对照组可见瘤细胞生长活跃，核异型性明显，核浆比例大，而游离核糖体丰富。联合用药组靶细胞改变出现时间早，程度重，主要发生在细胞质，表现为线粒体扩张呈空泡状或固缩，嵴和基质消失；微绒毛肿胀、内质网增生、扩张、细胞空泡样变性多见，而细胞膜变化不明显。联合用药组细胞凋亡数明显多于单独用药组，P＜0.05.
(4)脾脏HE染色显示正常对照组的脾脏组织光镜下见脾小梁，白髓排列整齐，淋巴小结未见增多，在小梁周围及白髓之间可见脾索与血窦，结构如常、丰富。模型组脾脏组织的红髓和脾小体结构多被破坏，甚至消失，镜下有淤血灶，T、B淋巴细胞均减少，淋巴滤泡缺如，可见红细胞被噬现象，含铁血黄素沉积及灶性坏死。可证实免疫抑制小鼠造模成功。CHMP2联合给药脾脏组织的红髓和脾小体排列稍紊乱，T淋巴细胞略减少，可见含铁血黄素沉积，无灶性坏死。脾脏组织的红髓和脾小体排列稍紊乱，可见淋巴小结，结构正常，未见坏死灶；CHMP1联合给药光镜(高倍镜)下可见脾细胞排列有序，红髓内可见大量巨噬细胞增生，白髓内亦可见明显密集增生的淋巴细胞和淋巴母细胞，髓索和髓窦分布有序。大剂量的顺铂可使小鼠白细胞数降低、骨髓有核细胞数降低，与对照组相比均有显著差异；体重降低，与对照组相比较有显著差异；而CHMP1、CHMP2与DDP联合给药的试验表明，CHMP1、CHMP2具有明显抵抗DDP副反应的作用。
(5)与对照组相比，CHMP联合DDP干预下，SKOV3卵巢癌细胞的上述指标均有不同程度的变化，表现为Fas及TNFR1表达升高而FasL表达降低，可使Caspase-8、Caspase-3活化，SKOV3卵巢癌细胞锌指蛋白A20表达降低。CHMP可以上调肿瘤细胞SKOV3的促凋亡基因Fas、TNFR1，下调抗凋亡基因FasL。DDP对肿瘤细胞Fas有明显的上调作用，DDP诱导肿瘤细胞FasL的表达具有双重作用。在发挥治疗作用，杀伤肿瘤细胞的同时，能够通过调节肿瘤细胞FasL蛋白的表达，影响肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用。
结论：(1)CHMP药血清均能抑制体外培养的卵巢癌细胞SKOV3的增殖，并诱导其凋亡。作用机制主要表现在大部分细胞被阻滞在DNA合成前期，抑制肿瘤细胞S、G2/M期的作用，使细胞停止于DNA的合成期或分裂末期，阻滞肿瘤细胞染色体的复制。与化疗药DDP具有协同作用。
(2)CHMP药血清、DDP对Fas/FasL介导卵巢癌细胞免疫逃逸的有逆转作用。
(3)CHMP具有体内抑瘤作用，改善荷瘤小鼠的一般状况，增加体重，提高荷瘤小鼠的生命延长率，诱导肿瘤组织细胞发生凋亡。CHMP2抑瘤作用优于CHMP1，CHMP1在改善荷瘤鼠的生存质量方面优于CHMP2，二者与DDP联合应用后可显著提高疗效。
(4)CHMP对化疗药物(DDP)有减毒作用，能使免疫抑制性小鼠一般状态、外周血白细胞、骨髓有核细胞均得到一定程度的恢复，并保护机体，减免化疗引起的损伤。对免疫抑制小鼠和正常小鼠均有一定的免疫增强作用。CHMP1、CHMP2相比，CHMP1的上述作用优于CHMP2。
(5)CHMP与DDP协同作用与其促进经典凋亡途径Fas-FasL和TNFa-TNFR1启动有关。