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一、研究背景无形体(Anaplasma)是一种胞内寄生菌,常寄生于血细胞引起无形体病。病原体可由多种蜱通过叮咬传播给人或动物,在家畜中广泛存在,也是一类人畜共患的蜱传疾病。无形体属包括,嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、山羊无形体(A.capra)、绵羊无形体(A.ovis)、边缘无形体(A.marginale)、中央无形体(A.centrale)、血小板无形体(A.platys)、牛无形体(A.bovis)。目前已测得全序的包括A.marginale、A.centrale、A.phagocytophilum。六种无形体中只有A.phagocytophilum,A.marginale,A.capra可以在体外分离到,其中A.phagocytophilum可以在HL60(人早幼粒白血病细胞)、ISE6(肩突硬蜱细胞)、IDE8(肩突硬蜱细胞)中生长,A.marginale可以在IDE8和BME26中生长,A.capra可以在HL60细胞中生长。目前,没有关于A.ovis体外分离培养的相关报道。目前,经报道可以引起人无形体病的有以下三种,A.phagocytophilum、A.capra、A.ovis变种。A.phagocytophilum于1994年首次被美国人报道可感染人,并于1996年分离到人来源的无形体。随后,人粒细胞无形体病在美国大量报道,欧洲多国和中国也均有报道。并可在人与人间传播。表现为发热、头痛、不适、肌痛、白细胞减少、血小板减少、转氨酶升高等。2015年首次报道了28例A.cpara感染人的病例,同时分离到人来源的病原体。临床表现为发热、头痛、乏力、眩晕等。体内靶细胞尚不明确。而关于A.ovis感染人一直存在争议,到目前为止仅有2007年发生在塞浦路斯的A.ovis变种感染人的一例报道。尚无关于病原体分离的报道。黑龙江省牡丹江地区和云南横断山区是我国两大重要的蜱媒病自然疫源地。以往的调查发现两地蜱和宿主动物携带多种蜱媒病原体,因此是监测的重点区域。绵羊无形体由于感染症状轻,长期以来缺乏系统研究,尤其是病原体的确认、分离鉴定的研究更是匮乏。二、研究目的调查媒介蜱和家畜中A.ovis的流行特征,并以此为依据评估当地绵羊无形体病对人群的威胁。从家畜中分离绵羊无形体,为后续绵羊无形体病血清学检测提供条件。开展基于哨点医院的人感染绵羊无形体的监测,旨在发现蜱传绵羊无形体病例,鉴定其病原学特征及描述病例临床表现特点。三、研究方法2014年至2016年,每年4月至8月采集黑龙江牡丹江地区及云南横断山区的蜱和宿主动物样本,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增样本中绵羊无形体特异的基因片段,进行针对绵羊无形体的宿主动物调查。使用HL-60细胞从牡丹江地区感染的山羊和绵羊血液中分离培养A.ovis,并通过PCR、瑞士吉姆萨染色IFA、FISH、扫描电镜等进行鉴定。开展基于哨点医院的绵羊无形体的主动监测,纳入两个月内有蜱叮咬史的病人,并通过调查问卷的形式来获得病人流行病学信息,住院病人信息则通过病案记录进行登记存档。本研究实验室检测以PCR对病人进行初筛,并结合IFA辅助绵羊无形体病的诊断。四、研究结果在牡丹江地区和横断山区开展绵羊无形体自然疫源地调查发现,游离蜱中A.ovis感染率为0.36%(6/1657),其中森林革蜱4只(4/275),全沟硬蜱1只(1/990),嗜群血蜱1只(1/239)。家畜中A.ovis感染率22.39%(150/670),牡丹江地区家畜绵羊无形体阳性率为12.10%(53/438),横断山区家畜绵羊无形体阳性率为41.81%(97/232)。使用HL-60细胞成功从家畜血液中分离培养A.ovis,并通过PCR、瑞士吉姆萨染色IFA、FISH、扫描电镜等手段对分离物进行了鉴定。2014-2016年共收集到蜱咬病人血样1631份,2010-2016年共收集386例蜱咬病人双份血清。针对2014-2016年主动监测PCR初筛阳性的蜱咬病人双份血清进行IFA检测。针对2010-2016所有蜱咬病人双份血清采用IFA方法进行回顾性调查。在主动监测和回顾性调查中各发现1例A.ovis感染患者。五、研究结论经过有针对性的对A.ovis媒介蜱和宿主动物调查,我们发现森林革蜱是牡丹江地区A.ovis的主要媒介蜱,绵羊、山羊和牛均是A.ovis的宿主动物。蜱及家畜中A.ovis的发现证实牡丹江地区为A.ovis的自然疫源地。通过HL-60细胞首次实现了A.ovis的分离培养并进行了鉴定。基于主动监测和回顾性调查中各发现了1例A.ovis感染病例,补充了A.ovis人的直接证据。也反映了A.ovis很难引起人无形体病。六、意义与创新性由于感染症状较轻,我们常常忽视绵羊无形体病,本研究显示绵羊无形体病在家畜中广泛存在,对人类有潜在威胁应予以足够的重视。首次实现了动物源A.ovis的分离培养,尽管A.ovis在HL-60细胞中的培养仅能维持四个月,但可以用来制作抗原片用于A.ovis感染的检测。临床感染病例的发现,为进一步研究绵羊无形体病的致病性和临床表现谱提供了重要依据。