湛江红树林中抗肺癌细胞生长和血管生成内生真菌的筛选

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[目的]:  1.湛江地区红树林内生真菌的分离、纯化和保存,并对分离的菌株进行分子生物学鉴定。  2.筛选能抑制肺癌细胞生长及肺癌体外血管生成的红树林内生真菌菌株。  [方法]:  1.采集湛江地区秋茄、红海榄、红树这3种红树林植物的根、茎、叶组织,分离、纯化和保存其中的内生真菌。  2.提取内生真菌DNA,采用PCR法用通用引物对内生真菌18S rDNA片段进行扩增,凝胶电泳观察PCR扩增产物后进行DNA序列测定,然后在GenBank数据库中采用BLAST法对序列进行相似度比对,用Mega5.0软件建立系统发育树,并对DNA序列测定的菌株进行分子生物学分类。  3.将低温保存的内生真菌菌株活化、扩大培养及发酵,离心分离发酵培养所获的各种内生真菌,分别收集发酵上清液进行实验。  4.采用MTT法分析各种内生真菌发酵上清液和菌丝体萃取物对肺癌细胞A549和NCI-H460生长增殖的影响;  5.建立HPV-16 E7癌蛋白诱导的肺癌体外血管生成模型,观察各种内生真菌发酵上清液对HPV-16 E7癌蛋白诱导的肺癌体外血管生成的影响。  [结果]:  1.本研究从湛江地区3种红树林植物的根、茎、叶等组织中分离、纯化了内生真菌共92株,其中从秋茄、红海榄、红树分离和纯化的内生真菌分别为33株、32株和27株,经DNA序列测定和BLAST序列比对成功鉴定出其中的62株菌株,主要包括新壳梭孢属、拟茎点霉属、拟盘多毛孢菌属、青霉菌属、木霉菌属、肉座菌属等。  2.MTT实验结果显示10株菌株,包括新壳梭孢属(Neofusicoccum sp.)4株—zj-2、zj-14、zj-17和zj-67;拟茎点霉属(Phomopsis sp.)4株—zj-12、zj-23、zj-36和zj-70;小光壳属(Leptosphaerulina sp.)和青霉菌(Penicillium sp.)各1株,分别为j-9和zj-25;其上清液能明显抑制肺癌细胞A549和NCI-H460细胞生长增殖,对A549细胞生长增殖抑制率分别为64.4%、59.5%、81.9%、43.9%、58.3%、56.2%、48.3%、42.4%、93.0%、49.7%,对NCI-H460细胞生长增殖的抑制率分别为41.2%、49.3%、82.7%、40.7%、53.9%、52.6%、56.8%、64.3%、91.0%、45.6%;其中以菌株j-9和zj-17抑制效果最好。  3.体外血管生成实验显示两株新壳梭孢属(zj-14和zj-17)和一株拟茎点霉属(zj-36)的上清液可抑制HPV-16 E7癌蛋白诱导的肺癌体外血管生成,对A549细胞体外血管生成抑制率分别为58.7%、75.8%和65%,对NCI-H460细胞体外血管生成的抑制率分别为80%、69.5%和81.8%。  [结论]:  本研究从秋茄、红海榄、红树3种红树林植物组织中分离、纯化了内生真菌共92株,成功鉴定了其中的62株菌株,筛选到了具有抗肺癌细胞生长增殖活性的菌株10株,具有抗肺癌血管生成活性的菌株3株。
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